Экспоненциальный закон надежности в кинетике инактивации ферментов. Общие свойства ферментов Влияние pH среды на активность амилазы слюны

Релаксационные методы основаны на том принципе, что при быстром внешнем воздействии на систему (изменение температуры, давления, пр.) время, которое нужно системе для достижения нового равновесия (или стационарного состояния), зависит от скорости химической реакции (и иногда от скорости диффузии реагентов.

Рассмотрим простейшую реакцию комплексообразования активного центра фермента с лигандом

В начале система находится в равновесии, которое характеризуется константой равновесия K 0 =K (T 0) и соответственно равновесными концентрациями,,
. Предположим, что в системе резко меняется температураT ->T 0 +T . Это приводит к изменению константы равновесияK ->K 0 +K , которое определяется отношением

(2.50)

где H – стандартное изменение энтальпии. После этого система переходит в новое равновесное состояние:

(2.51)

(2.52)

Уравнение (2.51) нелинейно. Предположим, что отклонение от равновесия невелико и тогда

и уравнение (2.51) преобразуется в линейное дифференциальное уравнение:

Решение этого дифференциального уравнения:

Величина

(2.54)

называется временем релаксации.

2.5. Влияние температуры и pH на скорость ферментативных реакций

Влияние этих факторов на скорость элементарной химической реакции было рассмотрено в Гл.1. Особенность состоит в том, что ферментативные реакции являются сложными многостадийными реакциями (состоящие из многих элементарных реакций). Кроме того, состояние молекул фермента в растворе характеризуется набором конформеров, обратимо переходящих друг в друга. Конформационные переходы молекулы определяются в значительной степени температурой и pHраствора.

2.6. Ингибирование ферментативных реакций

Вещества, подавляющие каталитическую активность ферментов, называются ингибиторами . Различают два основных класса ингибиторов –обратимые

(2.55)

(пестициды, зарин, зоман, аспирин и др.)

и необратимые (инактиваторы )

(2.55)

(окись углерода, цианид-ион, анальгин и др.)

2.7. Инактивация ферментов

Биополимерные молекулы (ферменты) являются термодинамически неустойчивыми и, как правило, с течением времени изменяют свою структуру и свойства. В большинстве случаев процесс инактивации может быть описан как переход между двуми состояниями фермента активного E a и неактивногоE i :

(2.56) Кинетика процесса описывается соответствующим дифференциальным уравнением

(2.57)

и характеризуется постоянной времени

(2.58)

Процесс инактивации фермента может иметь различную физико-химическую природу. Наиболее общим является тепловая денатурация, представляющая собой существенную перестройку макромолекулы, изменение третичной и частично вторичной структуры.

Для целей инактивации могут быть использованы кавитационный ультразвук, радиоактивное излучение и пр.

Изменение pHтакже может привести к денатурации фермента. При каждом значенииpHбелок характеризуется соответствующим распределением зарядов (ионогенные группы). При очень низких или очень высокихpHраспределение зарядов может существенно поляризовать молекулу, приводить к появлению изомеров и необратимо конформировать ее с разрушением структуры активного центра. Например:

Денатурацию фермента вызывают и денатурирующие агенты , разрушающие вторичную структуру белка (например, мочевина), а также окислительные процессы с участием кислорода.

При изучении таких процессов важная информация получена релаксационными методами. Как правило, конформационные изменения сопровождаются изменением окружения ароматических аминокислот – тирозина и триптофана (полоса поглощения излучения на 290 нм). Это проявляется в изменении спектров поглощения и флуоресценции.

Обратимые конформационные изменения обычно идут со временем 0.1-100 мс, а необратимые – 1-1000 мин.

Пример 1. Простейшая кинетическая схема инактивации с равновесием конформеров:

(2.59)

Кинетика процесса описывается одним характеристическим временем

(2.60)

Пример 2. Инактивации подвержены оба конформера:

(2.61)

(2.62)

Пример 3. Более общий случай для системы с участиемn конформеров:

Часто ферменты в растворе образуют димеры, и в димерной форме оказываются стабильнее. Тогда наблюдается диссоциативный механизм инактивации :

(2.65)

Следующая схема отражает возможные механизмы инактивации в процессе реакции (мономолекулярная инактивация свободной формы фермента, мономолекулярная инактивация фермен-субстратного комплекса, бимолекулярная инактивация фермента субстратом, бимолекулярная инактивация фермента продуктом):

(2.66)

Дискриминация механизмов инактивации и определение кинетических характеристик реакции обычно проводится несколькими методами:

анализируя зависимость выхода продукта от концентрации фермента;

устанавливая связь степени конверсии субстрата со степенью инактивированности фермента;

проведение реакции при низких степенях конверсии субстрата и низких концентрациях фермента;

проведение реакции при больших концентрациях фермента;

предынкубация фермента с компонентами реакции;

использование интегральных уравнений реакции.

Количество фермента, присутствующего в тканях в любой данный момент времени, определяется относи­тельными скоростями его синтеза и распада, а также кон­центрациями различного рода ингибиторов и активаторов. Как правило, распад ферментов и снижение их количества в среде происходят медленно. Ингибирование и активация ферментов могут осуществляться довольно быстро – в те­чение секунд.

Существует много методов для определения и выражения активности отдельных ферментов. Это обус­ловлено многообразием ферментов, наличием и использованием для определения их активности различных суб­стратов.

Международный биохимический союз предложил сле­дующее определение единицы фермента: «За единицу лю­бого фермента принимается то его количество, которое катализирует превращение одного микромоля субстрата в минуту при заданных стандартных условиях ». Число микромолей и будет равно числу стандартных единиц . Международная комис­сия предложила, если это возможно, проводить опре­деление активности фер­ментов при 30 °С и при оптимальных для фермен­тативной активности зна­чениях рН и концентра­ции субстрата.

Общие свойства фер­ментов вытекают из ихбелковой природы . Ферменты термолабильны, их активность зависит от рН среды и влажности , в которой они действуют, а также от влияния активаторов и ингибиторов .

При повышении температуры до определенных преде­лов активность ферментов усиливается . При достижении оптимальной для фермента температуры его каталитическая активность бывает наиболее высокой. Оптимальная температура для многих ферментов лежит чаще всего в пределах от 40 до 50 °С (оптимальная для растительных ферментов – 50 – 60 °С, а для ферментов животного происхождения – 40 – 50 °С). Однако оптимальная температура не является строго постоянной и зависит от многих при­чин, и в частности от продолжительности нагревания. Чем продолжительнее действие фермента, тем оптимальная температура должна быть ниже .

В интервале температур от 0 до 50 °С при повышении или понижении температуры на каждые 10 °С активность ферментов возрастает или соответственно падает в 1,4 – 2 раза. При дальнейшем нагревании активность ферментов снижается, и при 80 – 100 °С ферменты обычно полностью теряют каталитические свойства в связи с де­натурацией белка .

Температура инактивации (потери активности) у разных ферментов неоди­накова . Так, инактивация фермента амилазы в растворе происходит при 70 °С, сахаразы – при 59, трипсина и пепсина – при 65 °С. В сухом состоянии ферменты могут переносить нагревание до более высоких температур. Но при очень высоких температурах инактивация фер­ментов наступает мгновенно. При пастеризации, стерилизации, бланшировке и кипячении фермен­ты разрушаются .

После тепловой инактивации некоторые ферменты вос­станавливают свою каталитическую активность. Примером может служить пероксидаза, которая даже при нагревании в течение 60 с до 150 °С не полностью теряет каталитические свойства. Поэтому пероксидазу считают самым термостабильным ферментом.

При температурах ниже 0 °С каталитическая деятель­ность ферментов резко снижается, но все же сохраняется даже при замораживании продуктов .

Реакция среды оказывает существенное влияние на ка­талитическую активность ферментов. Ферменты изменяют свою растворимость, осмотическое давление, вязкость и другие свойства под влиянием рН среды. Полагают, что изменение ферментативной активности в зависимости от рН среды связано с изменением ионизации ферментов, суб­страта или фермент-субстратного комплекса .

Ферменты проявляют оптимальную активность только в определенных, свойственных им пределах рН . Так, пеп­син, который выделяется в сильнокислую среду желудка, имеет оптимум активности при рН 1,5 и 2,5. В то же время протеазы, которые выделяются поджелудочной железой в двенадцатиперстную кишку, имеют оптимальную актив­ность в щелочной зоне рН, а оптимум действия трипсина лежит в пределах рН 8 – 9. При значении рН выше или ниже оптимальной активность ферментов снижается .

Большинство ферментов бывают наиболее активными в нейтральных, слабощелочных или слабокислых средах. По мере сдвига значения рН от оптимальной в кислую или щелочную среду активность ферментов падает.

Активаторы и ингибиторы (парализаторы) ферментов могут соответственно усиливать или ослаблять и даже прекращать их деятельность. Активаторами ферментов являются ионы металлов: Na + , K + , Rb + , Mg 2+ , Ca 2+ , Cu 2+ , Fe 2+ и соединения, содержащие сульфгидрильные группы: SH, HCN, H 2 S . Наличие в растворе указанных металлов или соединений в определенной концентрации способствует проявлению полной активности некоторых фер­ментов.

Все ферменты подвержены ингибированию в ре­зультате денатурации или разрушения ферментного белка .

Сущность действия ингибиторов в большинстве слу­чаев состоит в том, что они соединяются с активными группами или активными центрами молекулы ферментов. Различают ингибиторы общего и специфического ха­рактера . К общим ингибиторам, которые подавляют дей­ствие всех ферментов , относят соли тяжелых металлов (свинца, серебра, ртути), трихлоруксусную кислоту и танин . Часто торможение или прекращение действия фер­ментов под влиянием тяжелых металлов носит обратимый характер, и если в среду добавить вещества, образующие соединения с этими металлами, то активность ферментов восстанавливается.

Специфические ингибиторы действуют только на опре­деленные ферменты. Так, синильная кислота действует только на окислительные ферменты, содержащие в актив­ном центре железо или медь. Синильная кислота вступает в соединение с металлами, и фермент теряет активность.

В живой клетке регулирование действия ферментов осуществляется не только с помощью специфических акти­ваторов и ингибиторов, но также путем связывания фер­ментов на различных коллоидных структурах прото­плазмы. Такое связывание ферментов приводит к потере ими активности. Освобождение фермента из соединения вновь восстанавливает его каталитическую активность.

Ферменты инактивируются при очень высоких давлениях . Однако после снятия давления ферменты восста­навливают свою каталитическую активность.

Действие ферментов сильно замедляется в сухих про­дуктах, однако полностью не прекращается . Результаты активности ферментов могут проявляться в изменении качества продукта – его потемнении, ухудшении аро­мата, вкуса, консистенции и т. д.

Скорость большей части ферментальных реакций про­порциональна концентрации фермента, по крайней мере, на самых ранних стадиях. За пределами начальных ста­дий скорость ферментативных реакций падает.

Фермент образует с субстратом комплекс, который диссоциирует на свободный фермент и конечный продукт реакции:

где Е – фермент; S – субстрат; ЕS – ферментно-субстратный комплекс; Р – конечный продукт.

Количество субстрата очень велико по сравнению с ко­личеством фермента, и поэтому концентрация субстрата сильно влияет на скорость ферментативных реакций. Если субстрат содержится в значительном избытке, то коли­чество образующегося продукта пропорционально вре­мени. По мере уменьшения концентрации субстрата ко­личество образующегося в единицу времени конечного продукта (Р) снижается.

О наличии в растворе фермента судят по его действию. Так, о наличии амилазы в слюне можно судить по спо­собности слюны осахаривать крахмал, о наличии желу­дочного пепсина – по его способности растворять с до­статочной быстротой яичный белок или фибрин.

Регулируя активность ферментов созданием соответствующей реакции среды, можно управлять скоростью катализируемых ими реакций, а также деятельностью ферментов, содержащихся в пищевых продуктах, что позволяет осуществлять мероприятия по хранению зерна, картофеля, плодов и овощей, производству ряда продуктов (вина, чая и т. д.).

Номенклатура и классификация ферментов

В начальный период развития учения о ферментах им давали названия без определенной системы, по случай­ным признакам, по названию субстрата или типу катали­зируемой реакции. Так, фермент пепсин получил назва­ние от греческого слова «пепсис» – перевариваю, папаин – от сока растения папайи, богатого ферментом. Случалось, что отдельные авторы одному и тому же фер­менту давали разные названия.

В связи с бурным развитием науки о ферментах – фер­ментологии в 1961 г. постоянным комитетом по ферментам при Международном биохимическом союзе была разра­ботана современная номенклатура и классификация ферментов. В соответствии с этой классификацией название фермента составлялось из химического названия суб­страта и названия той реакции, которая осуществлялась ферментом. К латинскому названию корня субстрата, на который действует фермент (сахароза – сахараза), или к названию процесса, катализируемого данным ферментом (гидролиз – гидролазы), добавлялось окон­чание «аза» . Наряду с новыми названиями для многих ферментов сохранились старые, прочно вошедшие в науч­ную литературу (пепсин, трипсин, папаин и др.).

По современной классификации все ферменты делят на шесть классов: оксидоредуктазы; трансферазы; гидро­лазы; лиазы; изомеразы; лигазы (синтетазы) . Классифи­кация ферментов основана на характере их действия.

Каждый класс подразделяют на подклассы, а каждый подкласс – на группы .

Оксидоредуктазы

Это ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции , которые проис­ходят в живых организмах. Реакции окисления веществ в организмах всегда сопровождаются реакциями восста­новления. Оксидоредуктазы делят на 14 подклассов (наиболее обширный класс ферментов).

Окисление протекает как процесс отнятия водорода (электронов) от субстрата, а восстановление – как при­соединение атомов водорода (электронов) к акцептору. Эту реакцию схематично можно представить в следующем виде:

АН 2 + В = А + ВН 2 ,

где АН 2 – вещество, отдающее свой водород и называемое донатором; В – вещество, отнимающее водород и назы­ваемое акцептором.

Окислению могут подвергаться разнообразные веще­ства – углеводы, жиры, белки, аминокислоты, вита­мины и др.

Роль оксидоредуктаз в живых тканях выполняют об­ширные группы дегидрогеназ и оксидаз , которые носят название в зависимости от окисляемого ими субстрата. Так, фермент, дегидрирующий яблочную кислоту, назы­вается малатдегидрогеназой, дегидрирующий этиловый спирт – алкогольдегидрогеназой и т. д.

В классе оксидоредуктаз основное значение имеют дегидрогеназы, которые осуществляют реакцию дегидри­рования. Все дегидрогеназы делят на две группы : анаэроб­ные и аэробные, которые называют оксидазами .

Анаэробные дегидрогеназы представляют собой спе­цифические ферменты, катализирующие отщепление водо­рода от определенных химических веществ и передающие его другим ферментам – переносчикам водорода. Эти де­гидрогеназы являются двухкомпонентными ферментами, в которых кофермент легко отделяется от белковой части. В качестве кофермента в состав анаэробных дегидрогеназ могут входить два вещества – никотин-амид-аденин-нуклеотид (НАД ) или никотин-амид-аделинин-нуклеотид-фосфат (НАДФ ). Оба эти вещества обладают исключительно вы­сокой реакционной окислительно-восстановительной спо­собностью.

Известно очень много анаэробных дегидрогеназ, ката­лизирующих окисление различных органических соедине­ний. Так, лактатдегидрогеназа катализирует реакцию окисления молочной кислоты до пировиноградной, изоцитратдегидрогеназа – окисление изолимонной кислоты до щавелево-янтарной.

К группеаэробных дегидрогеназ (оксидаз) относят ферменты, в состав которых в качестве кофермента входит витамин В 2 , (рибофлавин ), поэтому такие ферменты назы­вают флавиновыми . Флавиновые ферменты способны отни­мать водород от окисляемого вещества и передавать его другим соединениям или кислороду воздуха:

2Н 2 О 2 → 2Н 2 О + О 2 .

Отнимая водород от окисляемого вещества и передавая его кислороду воздуха, оксидаза может при этом образо­вывать воду или перекись водорода (Н 2 О или Н 2 О 2). К этой группе ферментов относятся полифенолоксидаза, аскорбинатоксидаза, глюкооксидаза.

Полифенолоксидаза представляет собой аэробную дегидрогеназу, для которой акцептором водо­рода является газообразный кислород .

Она действует на о-дифенолы, полифенолы, дубильные вещества и тирозин. Полифенолоксидаза широко распро­странена в грибах и высших растениях, особенно ее много в зеленом чайном листе. Действием полифенолоксидазы объясняется потемнение на разрезе мякоти плодов и ово­щей, картофеля, а также потемнение свежего чайного листа при его скручивании. Полифенолоксидаза играет большую роль в качестве промежуточного звена при дыха­нии растений.

Фермент пероксидаза наряду с полифенолоксидазой и цито­хромоксидазой активно участвует в процессах дыхания растений и защитных реакциях растений против фитопатогенных микроорганизмов растений.

Активная группа пероксидазы содержит железо . С по­мощью фермента пероксидазы за счет перекиси водорода и некоторых других органических перекисей происходит окисление органических соединений. Пероксидаза обра­зует комплексное органическое соединение, вследствие чего перекись активируется и приобретает способность действовать как акцептор водорода:

Многие органические соединения реагируют с кисло­родом воздуха и образуют перекиси. Особенно легко обра­зуются перекиси при окислении кислородом воздуха соединений, имеющих непредельные связи: каротиноидов, ненасыщенных жирных кислот, некоторых углеводородов.

Фермент каталаза катализирует процесс расщеп­ления перекиси водорода на воду и кислород:

В состав молекулы каталазы, как и пероксидазы, вхо­дит железо . Главное назначение каталазы в организме состоит в том, что она разрушает вредную для клеток перекись водорода, образующуюся в процессе дыхания.

Фермент липоксигеназа катализирует образо­вание перекисей и гидроперекисей при окислительной порче жиров.

Скорость ферментативной реакции, иными словами, активность фермента определяется также присутствием в среде активаторов и ингибиторов: первые повышают скорость реакции и иногда модифицируют ее, вторые - тормозят реакцию. Среди химических соединений, оказывающих влияние на активность ферментов, встречаются разнообразные вещества. Так, НС1 активирует действие пепсина, желчные кислоты - панкреатической липазы; некоторые тканевые ферменты (оксидоредуктазы, катепсины, аргиназа), растительная протеиназа папаин и др. в значительной степени активируются соединениями, содержащими свободные SH-группы (глутатион, цистеин), а некоторые также витамином С. Особенно часто в качестве активаторов служат (выступают) ионы двухвалентных и иногда одновалентных металлов. Многие ферменты вообще не активны в отсутствие металлов. Так, при удалении цинка угольная ангидраза практически лишена ферментативной активности; более того при действии этого фермента цинк не может быть заменен никаким другим металлом. Известны ферменты, действие которых активируется рядом металлов, в частности, енолаза (см. Углеводный обмен) активируется Mg 2+ , Mn 2+ , К + . В табл. 18 приведены примеры участия металлов в действии некоторых ферментов.

Таблица 18. Металлы в активировании некоторых ферментов 1 (1 Обычно трудно провести границу между металлоферментами (металл связан комплексно н незаменим) и ферментами, активируемыми металлами (последние лишь ускоряют реакцию и легко диссоциируют). )
Фермент	Металл	Фермент	Металл
Цитохромы	Fe	Амилаза	Са
Каталаза	Fe	Липаза	Са
Пероксидаза	Fe	Карбоангидраза	Zn
Триптофаноксидаза	Fe	Лактатдегидрогеназа	Zn
Гомогентизиказа	Fe	Уриказа	Zn
Аскорбатоксидаза	Си	Карбоксипептидаза	Zn
Тирозиназа	Си	Пептидазы	Mg
Фенолоксидаза	Си	Фосфатазы	Mg
Ксантиноксидаза	Мо	Фосфоглюкокиназа	Mg
Нитратредуктаза	Мо	Аргиназа	Mn
Альдегидоксидаза	Мо	Фосфоглюкомутаза	Mn
Пептидазы	Со	Холинэстераза	Mn

Относительно роли металлов в активирующем действии ферментов имеющиеся данные свидетельствуют о том, что в ряде случаев ионы металлов (Со 2+ , Mg 2+ , Zn 2+ , Fe 2+) выполняют функции простетических групп ферментов. В других случаях они способствуют присоединению субстрата к активному центру и образованию фермент-субстратного комплекса. Например, ионы Mg 2+ через отрицательно заряженную фосфатную группу обеспечивают присоединение монофосфорных эфиров органических веществ к активному центру фосфатаз, катализирующих гидролиз этих соединений. В ряде случаев металл соединяется с субстратом, образуя истинный субстрат, на который действует фермент. В частности, ионы Mg 2+ активируют креатинфосфокиназу благодаря образованию истинного субстрата и магниевой соли АТФ. Наконец, имеются экспериментальные доказательства прямого участия металлов (например, ионов Са 2+ в молекуле амилазы слюны) в формировании и стабилизации активного центра и всей третичной структуры молекулы фермента. Следует отметить также нередкую роль мeталлов в качестве аллостерических модуляторов (см. рис. 59). Взаимодействуя с аллостерическим центром, подобный металл (модулятор) способствует образованию наиболее выгодной пространственной конфигурации фермента и активного фермент-субстратного комплекса.

Анионы при физиологических концентрациях обычно неэффективны или оказывают небольшое активирующее влияние на ферменты. Исключение составляют пепсин, некоторые оксидоредуктазы, активируемые анионами, а также слюнная амилаза, катализирующая гидролиз крахмала, активность которой повышается ионами хлора, и аденилатциклаза, которая активируется анионами галогенов.

Ингибиторами принято называть вещества, вызывающие частичное или полное торможение реакций, катализируемых ферментами. Поскольку ферменты являются белками, любые агенты, вызывающие денатурацию белка (нагревание, кислоты, щелочи, соли тяжелых металлов), приводят к инактивации фермента. Однако подобное инактивирование относительно неспецифично. Оно не связано с механизмом действия ферментов. Гораздо большую группу составляют так называемые специфические ингибиторы, которые оказывают свое действие на один какой-либо фермент или на группу родственных ферментов. Исследование этих ингибиторов имеет важное значение по ряду причин.

Во-первых, ингибиторы могут дать ценную информацию о природе активного центра фермента, а также его функциональных групп и химических связей, обеспечивающих образование фермент-субстратного комплекса. Известны вещества, специфически связывающие ту или иную группу в молекуле фермента, выключая ее из сферы химической реакции. В частности, йодацетат IСН 2 -СООН, его амид и этиловый эфир, парахлормеркурибензоат ClHg - С 6 Н 4 -СООН и другие реагенты сравнительно легко вступают в химическую связь с некоторыми SH-группами ферментов. Если такие группы существенны для акта катализа, то добавление подобных ингибиторов приводит к полной потере активности фермента:

R-SH + IСН 2 -СООН --> HI + R-S-СН 2 -СООН

Ряд других ферментов (холинэстераза, трипсин и химотрипсин) сильно тормозится некоторыми фосфорорганическими соединениями, в частности диизопропилфторфосфатом (ДФФ), вследствие блокирования ключевой гидроксильной группы сери-на в активном центре (см. выше).

Во-вторых, ингибиторы нашли широкое применение в энзимологии при исследовании природы множественных форм ферментов и изоферментов, отличающихся не столько по электрофоретической подвижности, сколько по различию реакций на один и тот же ингибитор.

При помощи ингибиторов, избирательно выключающих отдельные стадии многоступенчатого метаболического процесса, могут быть точно установлены последовательность химических реакций и природа участвующих ферментов. В частности, этим путем при применении йодацетата, фторида и других ингибиторов был расшифрован гликолитический путь окислительно-восстановительных превращений глюкозы до молочной кислоты в мышечной ткани (см. Обмен углеводов), насчитывающий 11 стадий с участием 11 ферментов и 10 промежуточных метаболитов.

На ингибировании ферментов основан механизм действия многих токсинов и ядов на организм. Так, известно, что при отравлениях синильной кислотой смерть наступает вследствие полного торможения дыхательных ферментов (цитохромоксидазы), в особенности клеток мозга. Токсическое влияние на организм человека и животных некоторых инсектицидов обусловлено торможением активности холинэстеразы - фермента, играющего первостепенную роль в деятельности нервной системы.

Рациональная химиотерапия - осознанное применение лекарственных препаратов в медицине, должна опираться на точное знание механизма их действия, на биосинтез ферментов или работу их в организме. Иногда метод лечения болезней человека включает применение избирательных ингибиторов. Так, ингибитор трипсина, химотрипсина и калликреина трасилол широко используется при лечении острого панкреатита. Избирательное ингибиторное действие на ферменты некоторых природных и синтетических соединений (так называемых антиметаболитов) в настоящее время служит основой для разработки эффективных методов синтеза химиотерапевтических препаратов. На этом пути открываются широкие возможности регуляции как синтеза ферментов, так и интенсивности метаболизма.

Типы ингибирования. Несмотря на то что механизм действия большинства ингибиторов не выяснен, обычно различают обратимое и необратимое ингибирование. Если молекула ингибитора вызывает стойкие изменения или модификацию функциональных групп фермента, то такой тип ингибирования называется необратимым. Чаще, однако, имеет место обратимое ингибирование, поддающееся количественному изучению на основе уравнения Михаэлиса - Ментен. Обратимое ингибирование в свою очередь разделяют на конкурентное и неконкурентное, в зависимости от того, удается или не удается преодолеть торможение ферментативной реакции путем увеличения концентрации субстрата. Во втором случае повышение концентрации субстрата не изменяет степень ингибирования фермента.

Конкурентное ингибирование может быть вызвано веществами, имеющими структуру, похожую на субстрат, но немного отличающуюся от структуры истинного субстрата. Классическим примером подобного типа ингибирования является торможение активности сукцинатдегидрогеназы малоновой кислотой. Этот фермент катализирует окисление путем дегидрирования янтарной кислоты в фумаровую в соответствии со схемой:

Если в среду добавить малоновую кислоту (ингибитор), то в силу структурного сходства ее с истинным субстратом янтарной кислотой (наличие двух таких же ионизированных карбоксильных групп) она будет реагировать с активным центром с образованием фермент-ингибиторного комплекса (см. схему), однако при этом перенос водорода от малоната не происходит. Так как структуры субстрата - янтарной кислоты и ингибитора - малоната все же несколько отличаются, они конкурируют за связывание с активным центром, и степень торможения будет определяться соотношением концентраций малоната и сукцината, а не абсолютной концентрацией ингибитора. Этот тип ингибирования иногда называют ингибированием по типу метаболического антагонизма (рис. 56).

В общей форме реакция взаимодействия ингибитора с ферментом может быть представлена следующим уравнением:

Образовавшийся комплекс, называемый фермент-ингибиторным комплексом (EI), в отличие от ES не распадается с образованием продуктов реакции. Константу диссоциации EI-комплекса или ингибиторную константу (K 1) можно, следуя теории Михаэлиса - Ментен, определить как отношение констант обратной и прямой реакций:

т. е. ингибиторная константа прямо пропорциональна произведению концентрации фермента и ингибитора и обратно пропорциональна концентрации ЕI-комплекса.

Метод конкурентного торможения нашел широкое применение в медицинской практике. Известно, например, что для лечения некоторых инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями, применяют сульфаниламидные препараты. Оказалось, что эти препараты имеют структурное сходство с парааминобензойной кислотой, которую бактериальная клетка использует для синтеза фолиевой кислоты, являющейся составной частью ферментов бактерий. Благодаря этому структурному сходству сульфаниламид, например, блокирует действие фермента путем вытеснения парааминобензойной кислоты из комплекса с ферментом, синтезирующим фолиевую кислоту, что ведет к торможению роста бактерий.

Некоторые аналоги витамина В 6 и фолиевой кислоты, в частности дезоксипиридоксин и аминоптерин (см. Витамины), действуют как конкурентные, так называемые коферментные ингибиторы (или антивитамины), тормозящие многие биохимические процессы в организме.

Неконкурентное ингибирование вызывается веществами, не имеющими структурного сходства с субстратами и часто связывающимися не с активным центром, а в другом месте молекулы фермента. Степень торможения во многих случаях определяется продолжительностью действия ингибитора на фермент. При данном типе ингибирования благодаря образованию стабильной ковалентной связи фермент часто подвергается полной инактивации, и тогда торможение становится необратимым. Примерами неконкурентного ингибирования (инактивации) является действие йодацетата, диизопропилфторфосфата, а также диэтил-n-нитрофенилфосфата и синильной кислоты, заключающееся в связывании и выключении функциональных групп или ионов металлов в молекуле фермента.

Для выяснения вопроса о типе ингибирования пользуются уравнением Михаэлиса - Ментен, графиком Лайнуивера - Бэрка и другими более усовершенствованными уравнениями, например уравнением Эди - Хофсти:

v = - К m (0/[S]) + V mах

и соответствующими графиками в прямолинейных координатах. В приведенных ниже графиках, построенных в координатах v и [S], а также в координатах 1/v и 1/[S], V - максимальная скорость реакции, V 1 - максимальная скорость в присутствии ингибитора, К 1 - ингибиторная константа; все остальные символы были представлены выше.

Видно, что при конкурентном типе ингибирования (рис. 57) ингибитор увеличивает значение К m (на величину, равную разнице в длине отрезков, отсекаемых от оси абсцисс), не оказывая влияния на максимальную скорость. Это означает, что при достаточно высокой концентрации субстрата [S] ингибитор вытесняется молекулами субстрата из комплекса EI. При неконкурентном ингибировании (рис. 58) ингибитор снижает величину максимальной скорости. Если при этом величина К m не уменьшается, то говорят о полностью неконкурентном ингибировании. Подобный тип ингибирования имеет место при образовании неактивных, труднодиссоциирующих комплексов EI и (или) EIS. Часто, однако, имеет место смешанный тип ингибирования (иногда называемый частично неконкурентным типом), при котором снижение V mах сочетается с увеличением К m . Это означает, что комплекс EI сохраняет частичную активность, т. е. способность к образованию промежуточного тройного комплекса EIS, в котором субстрат подвергается замедленному каталитическому превращению. В редких случаях степень торможения активности фермента может увеличиваться с повышением концентрации субстрата; для этого типа торможения был предложен довольно неточный термин бесконкурентный (от англ. uncompetitive). Один из механизмов такого торможения обусловлен возможностью соединения ингибитора с комплексом ES с образованием неактивного или медленно реагирующего тройного комплекса ESI.

Таким образом, при графическом анализе скоростей ферментативных реакций как функции концентраций субстрата может быть получена ценная информация по кинетике ферментативных реакций, освещающая возможный механизм ферментативного катализа.

Регуляция активности ферментов

Выше было указано, что одним из уникальных свойств живых организмов является удивительная способность к сбалансированности катаболических (биодеградативных) и анаболических (биосинтетических) процессов. Хотя в клетках одновременно совершаются процессы синтеза, распада и взаимопревращения сотен и тысяч разнообразных веществ, имеется множество регуляторных механизмов, обеспечивающих постоянство внутренней среды организма. Некоторые из этих регуляторных механизмов, среди которых важная роль принадлежит механизмам регуляции активности ферментов, будут рассмотрены ниже.

Влияние закона действия масс. В катализируемой ферментом обратимой химической реакции, например A+B C+D, концентрация компонентов реакции и соответственно направление реакции будут регулироваться влиянием закона действия масс. Оно, в частности, может быть показано в обратимой реакции трансаминирования, катализируемой аланинаминотрансферазой:

Аланин + α-Кетоглутарат Пируват + Глутамат.

Этот тип регуляции играет, очевидно, лишь ограниченную роль, поскольку в реальных условиях реакция обычно протекает в одном направлении, так как образовавшиеся продукты могут оказаться субстратами для действия других ферментов и выводиться из сферы реакции; в этих случаях устанавливается скорее устойчивое (стационарное) состояние, чем истинное равновесие.

Изменение количества фермента. У бактерий хорошо изучен феномен индуцированного синтеза ферментов при выращивании их на среде, где единственным источником углерода и энергии служит тот или иной углевод, допустим, глюкоза. Замена глюкозы в среде на лактозу приводит к индуцированному или адаптированному (после небольшого периода лагфазы) синтезу фермента галактозидазы (программированному лактозным геном, см. Синтез белка), расщепляющей лактозу на глюкозу и галактозу. В животных тканях подобный быстрый синтез ферментов наблюдается сравнительно реже, и механизм, индуцирующий синтез, изучен только для небольшого числа ферментов (тирозинтрансаминазы, серин- и треониндегидратазы, триптофанпирролазы и др.). Однако при поступлении в организм некоторых ядов, канцерогенных веществ, алкалоидов, инсектицидов и др. наблюдается резкое увеличение через несколько дней активности (соответственно количества) ферментов - гидроксилаз гладкого эндоплазматического ретикулума клеток печени; окисляющих чужеродные вещества в нетоксичные для организма продукты. С другой стороны, описаны случаи, когда под действием подобных гидроксилаз чужеродные вещества превращаются в организме в более токсичные соединения. Это явление, обратное детоксикации, получило название летального синтеза.

Проферменты. Протеолитические ферменты желудочно-кишечного тракта и поджелудочной железы синтезируются в неактивной форме, в виде проферментов (зимогенов). Регуляция в этих случаях сводится к превращению проферментов в активные ферменты под влиянием специфических агентов. Так, трипсин синтезируется в поджелудочной железе в форме трипсиногена. Последний превращается в активный трипсин в кишечнике под действием другого белкового фермента - энтерокиназы, впервые открытого в лаборатории И. П. Павлова. Установлено, что активирующее действие энтерокиназы сводится к отщеплению от трипсиногена гексапептида, приводящему к формированию нативной третичной структуры трипсина и его активного центра (см. выше); наблюдается также аутокатализ. Превращение неактивного пепсиногена в активный пепсин осуществляется аутокаталитически в результате ограниченного протеолиза в присутствии НС1 и также связано с отщеплением от первого специфического ингибитора полипептидной природы (см. Обмен простых белков). Синтез протеиназ в неактивной форме и ряда других неактивных белков-предшественников имеет, очевидно, определенный биологический смысл, предотвращая разрушение клеток органов, в которых образуются проферменты.

Химическая модификация фермента. Выше было указано (см. Химия белков), что ряд белков при формировании третичной структуры подвергается постсинтетической модификации. Оказалось, что ключевые ферменты энергетического обмена - фосфорилаза, гликогенсинтетаза и др. - также контролируются путем фосфорилирования и дефосфорилирования, осуществляемого специфическими ферментами - протеинкиназой и протеинфосфатазой, уровень активности которых в свою очередь регулируется гормонами (см. Обмен углеводов). Уровень активности ключевых ферментов и соответственно интенсивность процессов обмена будут определяться соотношением фосфорилированных и дефосфорилированных форм этих ферментов.

Регуляция активности ферментов по принципу обратной связи. Во многих строго биосинтетических реакциях основным типом регуляции скорости многоступенчатого ферментативного процесса является ингибирование по принципу обратной связи, когда конечный продукт биосинтетической цепи подавляет активность фермента, катализирующего первую стадию.

Предположим, что в клетках осуществляется многоступенчатый биосинтетический процесс, каждая стадия которого катализируется собственным ферментом:

Скорость подобной суммарной последовательности реакций в значительной степени определяется концентрацией конечного продукта (Р), накопление которого выше допустимого уровня оказывает мощное ингибирующее действие на первую стадию процесса, соответственно на фермент E 1 .

Впервые существование подобного механизма контроля активности ферментов метаболитами было показано у Е. coli при исследовании синтеза изолейцина и цитидинтрифосфата (ЦТФ). Оказалось, что изолейцин, являющийся конечным продуктом, избирательно подавляет активность треониндегидратазы, катализирующей первое звено процесса превращения треонина в изолейцин, насчитывающего пять ферментативных реакций. Аналогично ЦТФ как конечный продукт биосинтетического пути оказывает ингибирующий эффект на первый фермент (аспартаттранскарбамоилазу), регулируя тем самым свой собственный синтез. Этот тип ингибирования получил название ингибирования по принципу обратной связи или ретроингибирования. Существование его доказано во всех живых организмах, и в настоящее время он рассматривается как один из ведущих типов регуляции активности ферментов и клеточного метаболиза в целом 1 . (1 Следует указать, что скорость реакции (как и активность ферментов) в чисто биодеградативных (катаболических) процессах регулируется промежуточными продуктами, являющимися индикаторами энергетического состояния клетки (пуриновые нуклеотиды, пирофосфат, неорганический фосфат и др.). )

С другой стороны, в амфиболических процессах (см. Введение в обмен веществ и энергии), выполняющих одновременно биосинтетические и биодеградативные функции 2 , доказано существование регуляции как по типу ретроингибирования, так и макроэргами - индикаторами энергетического состояния клетки. (2 К амфиболическйм процессам относят такие пути, как гликолиз, гликогенолиз, цикл трикарбоновых кислот, гексозомонофосфатный путь, трансаминирование аминокислот (см. Обмен веществ) ). Для амфиболических процессов уникальным типом регуляции, свойственным только им, является, кроме того, активация предшественником, когда первый метаболит в многоступенчатом пути активирует фермент, катализирующий последнюю стадию. Так, доказано активирующее влияние глюкозо-6-фосфата, являющегося предшественником гликогена, на фермент гликогенсинтетазу.

Подобные типы ингибирования конечным продуктом и активирования первым продуктом свойственны аллостерическим (регуляторным) ферментам (см. выше), когда эффектор, структурно отличаясь от субстрата, связывается в особом (аллостерическом) центре молекулы фермента, пространственно удаленном от активного центра. Поэтому принято различать аллостерический тип регуляции, включающий как аллостерическое ингибирование, так и аллостерическую активацию. Взаимопревращения активного и неактивного аллостерического фермента в упрощенной форме, а также конформационные изменения, наблюдаемые при присоединении субстрата и эффекторов, представлены на рис. 59.

Видно, что присоединение отрицательного эффектора к аллостерическому центру вызывает значительные изменения конфигурации активного центра молекулы фермента и как результат потерю сродства фермента к своему субстрату (образование неактивного комплекса).

Аллостерические взаимодействия проявляются в характере кривых зависимости начальной скорости реакции от концентрации субстрата или эффектора, в частности в S-образности кривых (отклонение от гиперболической кривой Михаэлиса - Ментен). Это означает, что связывание одной молекулы субстрата облегчает связывание второй молекулы у аллостерического центра, способствуя тем самым повышению скорости реакции. Кроме того, для регуляторных (аллостерических) ферментов характерна нелинейная зависимость скорости реакции от концентрации фермента.

Другие типы регуляции активности ферментов. Существует ряд других механизмов, контролирующих скорость метаболических процессов и активность внутриклеточных ферментов. К подобным механизмам могут быть отнесены конкуренция ферментов за общий субстрат, выключение активности одного из нзоферментов (у множественных форм ферментов), влияние концентраций кофакторов и их формы (в особенности ионов металлов) и явление компартментализации. Механизм компартментализации играет, по-видимому, важную биологическую роль, пространственно разъединяя посредством биомембран ферменты от своих субстратов (например, лизосомальные ферменты: протеиназы, фосфатазы, рибонуклеазы и другие гидролитические ферменты, от веществ, на которые они действуют в цитоплазме) или взаимно несовместимые в одно и то же время метаболические процессы. Примером последних могут быть пути синтеза жирных кислот, протекающие в основном в растворимой фракции цитоплазмы, и пути распада жирных кислот, сосредоточенные в митохондриях.

Определение активности ферментов

Определение количественного содержания ферментов в биологических объектах представляет известные трудности, поскольку, за редким исключением, ферменты в тканях присутствуют в ничтожно малых концентрациях. Поэтому о количестве ферментов судят по скорости катализируемой реакции, в определенных согласованных условиях измерения. При оптимальных условиях температуры, pH среды и полном насыщении фермента субстратом скорость пропорциональна концентрации фермента. О скорости ферментативной реакции судят или по скорости убыли субстрата, или по скорости образования продукта реакции.

Для выражения концентрации фермента Комиссией по ферментам Международного биохимического союза рекомендована стандартная единица (Е). За единицу любого фермента принимается то количество его, которое в оптимальных условиях катализирует превращение 1 мкмоль субстрата в минуту (мкмоль/мин). Предложено новое определение международной единицы фермента катал (кат, kat), соответствующее количеству фермента, способному вызывать превращение 1 моль субстрата в продукт в 1 с (1 моль/с). Отношение международной единицы (Е) к каталу можно выразить следующим образом:

или 1 Е=1 мкмоль · мин -1 = (1/60) мкмоль · с -1 = (1/60) мккат = 16,67 нкат. Таким образом, 1Е фермента соответствует 16,67 нкат.

Рекомендовано, кроме того, проведение измерения единиц фермента при 25°С, оптимуме pH и концентрации субстрата, превышающей концентрацию насыщения. В этих случаях скорость соответствует нулевому порядку реакции в отношении субстрата и будет зависеть только от концентрации фермента.

Для выражения активности фермента пользуются определением удельной и молекулярной активности. Удельную активность фермента принято выражать числом единиц ферментативной активности на 1 мг белка (или числом каталов на 1 кг активного белка). Число молекул субстрата, подвергающихся превращению одной молекулой фермента в минуту, принято называть числом оборотов, или молекулярной активностью. Так, одна молекула каталазы эритроцитов способна расщепить в 1 мин 5 · 10 6 молекул перекиси водорода 1 . (1 Для того чтобы 1 атом неорганического железа, также катализирующий распад Н 2 O 2 , расщеплял такое число молекул Н 2 O 2 , которое расщепляет каталаза в 1 с, потребовалось бы более 300 лет. Этот пример является наглядным доказательством одного из главных свойств ферментов - их высокой каталитической активности. )

Преподаватель:
к.б.н
Кузнецова Екатерина Игоревна

Механизмы инактивации ферментов
1. Изменение первичной структуры:
1.1. Разрыв полипептидной цепи:
Жесткие условия (длительное кипячение в HCl) –
гидролиз до отдельных ам-т.
При нагревании до 100 °С (pH 7-8), гидролиз
пептидных связей незначителен.
Наиболее чувствительными к
высокотемпературному гидролизу являются
пептидные связи, образованные остатками
аспарагиновой кислоты.
Протеазы (бактериальное загрязнение, автолиз).

Решение:


инактивированных ферментов.

1.2.Окисление функциональных групп фермента
SH-группы цистеина и индольные фрагменты
триптофана, при повышенной температуре, могут
окисляться (сульфокси- соединения цистеина
(SOH, SO2H) и образовываться продукты
раскрытия индольного кольца триптофана.

Решение:
Реактивировать с помощью восстанавливающих
агентов, в частности низкомолекулярных тиолов
(например, цистеин или дитиотрейтол) .

Вызывают: Тиолы и другие восстановленные
соединений серы, например Na2SO3, Na2S2O3.
Продуктом восстановления дисульфидной связи
(S-S) является:
1) тиольная форма (белок–SH)
2) смешанный дисульфид тиольной формы белка с
восстанавливающим реагентом, например
белок–S–SO3).

1.3. Расщепление дисульфидных связей
Щелочной гидролиз цистеина →дегидроаланин→
Благодаря нуклеофильным свойствам
взаимодействует с NH2-группами лизина и SHцистеина →лизиноаланин и лантионин.
Для полной деструкции всех S–S связей требуются достаточно жесткие условия (0,1–1М щелочь,
100 °С).
Однако деструкция наиболее реакционноспособных
S–S связей может проходить в достаточно мягких
условиях – например, при температурах 60–80 °С и
слабощелочных значениях рН.
Cледует учитывать при использовании ферментов в
качестве добавок к моющим средствам.

Решение:
Добавление в среду тиолов приведет к
расщеплению смешанного дисульфида и
последующему образованию правильной S–S связи

1.4. Химическая модификация каталитических SHгрупп.
Катионы тяжелых металлов (Hg, Pb и Cu)
связываются с SH-групп активного центра
фермента
↓
Образование соответствующих меркаптидов
↓
Фермент инактивируется

10.

1.5. Фосфорилирование белков in vivo.
Под действием фосфорилазы и фосфатазы,
содержащихся в полуочищенных ферментативных
препаратах в виде примесей
↓
Фосфорная кислота связывается с ОН-группами
серина и треонина.
↓
Конформационные изменения в белковой
молекуле
↓
инактивацию фермента.

11.

Решение:
В литературе практически отсутствуют примеры
удачной реактивации подобным образом
инактивированных ферментов.

12.

1.6. Дезаминирование остатков аспарагина.
При температурах (порядка 100 °С) и рН (порядка
4,0–5,0) происходит дезаминирование остатков
аспарагина.
↓
инактивации фермента.

13.

Решение:
В литературе практически отсутствуют примеры
удачной реактивации подобным образом
инактивированных ферментов.

14.

1.7. Радиационная инактивация ферментов
γ-облучение и УФ-свет
Воздействуют на функциональные группы
ферментов, пептидные связи и SH-группы
остатков цистеина.

15.

2. Агрегация
Наблюдается при повышенной температуре, при
экстремальных значениях рН, в присутствии
некоторых химических соединений.
Чем выше концентрация, тем быстрее идет
агрегация.
Гидрофобные взаимодействия и водородные
связи, возможно образование дисульфидных
мостиков между отдельными белковыми
молекулами

16.

Решение:
Необходимо разрушить межмолекулярные
ковалентные и нековалентные контакты c
помощью концентрированных растворов
мочевины и гуанидинхлорида, экстремальных
значений рН.
Если при агрегации ферментов образовались
межмолекулярные S-S -мостики, в среду вносят в
относительно невысоких концентрациях
(мкмоль/л) тиолсодержащие реагенты (например,
цистеин или дитиотрейтол).
При таких концентрациях внутримолекулярные
S–S связи в белке, как правило, не затрагиваются.

17.

3. Инактивация ферментов поверхностным
натяжением
Поверхностное натяжение на границе раздела
между воздухом и чистой водой составляет 80
дин/см.
Пенообразование вызывает денатурацию
ферментов, адсорбированных на границе раздела
фаз.

18.

Решение:
Добавление ПАВ снижает поверхностное
натяжение до 1 дин/см.

19.

4. Сорбция белка на стенках реакционного
сосуда
Сорбция за счет нековалентных взаимодействий
приводит к уменьшению концентрации фермента в
растворе.
Необходимо учитывать при работе с
разбавленными белковыми растворами
(концентрация 10-8–10-10 моль/л).
Под влиянием денатурирующих факторов
способность белков сорбироваться на стенках
реакционного сосуда может возрастать.

20.

Решение:
Десорбция фермента со стенок реакционного
сосуда достигается за счет разрушения
неспецифических взаимодействий между
белком и сорбционными центрами на поверхности
сосуда.
Можно использовать экстремальные значения рН,
концентрированные растворы мочевины или
гуанидинхлорида.

21.

5. Диссоциация олигомерных белков на
субъединицы
Вызывают: Мочевина, детергенты, кислоты или же
нагревание.
Приводят к:
конформационным изменениям отдельных
субъединиц;
агрегации субъединиц;
диссоциации кофакторов из активных центров;
модификации функциональных групп, которые в
олигомерном белке были экранированы от
контакта с растворителем.

22.

6. Десорбция кофактора из активного центра
фермента
Вызывает: нагревание, действие хелаторов, диализ
Если диссоциация кофактора сопровождается
значительными конформационными сдвигами или
химической модификацией важных
функциональных групп → фермент
инактивируется необратимо.
Если при этом не произошло существенного
изменения белковой конформации, то добавление
в среду избытка кофактора приводит к
реактивации фермента.

23.

Регенерация кофакторов
Способы регенерации:
Ферментативный (методы с использованием сопряженных субстратов или ферментов)
Неферментативный (химические и
электрохимические подходы)

24.

Ферментативный способ

В систему вводят избыточное количество
сопряженного субстрата того же фермента:
Пример: при работе алкогольдегидрогеназы
расходуется НАДН.

25.

Ферментативный способ
1. Использование сопряженных субстратов.
Недостатка:
используются высокие концентрации
сопряженного субстрата, так как равновесие
реакции сильно сдвинуто в сторону
образования спирта;
усложняет процедуру выделения основного
продукта из реакционной смеси.

26.

Ферментативный способ
2. Использование сопряженных
ферментативных реакций
В систему, дополнительно вводят фермент 2,
функционирование которого обеспечивает
регенерацию кофермента.
Используемые в системе ферменты должны иметь
разную субстратную специфичность

27.

Неферментативные способы
1. Химические методы.
Используются дитионит натрия и некоторые
соли пиридиния:
+ Низкая стоимость.
- могут ингибировать отдельные ферменты.
Флавиновые коферменты

28.

Неферментативные способы
2. Электрохимические методы.
Прямое электрохимическое восстановление или
окисление.
“-” появления в процессе регенерации
ферментативно неактивных форм кофермента,
например в результате его димеризации.

29. СТАБИЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ В БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ

30.

Проблемы возникающие при использовании
ферментов в биотехнологических процессах:
1. Повышенные температуры
2. Экстремальные значения pH
3. Высокие концентрации органических
растворителей или ПАВ.
4. Невозможность многократно использовать
фермент.
5. Сложность при разделении фермента от
продукта.

31.

Основные подходы для стабилизации
ферментов:
1. Добавление стабилизирующих веществ в среду,
в которой хранится фермент или проводится
ферментативная реакция.
2. Химическая модификация фермента.
3. Иммобилизация фермента.

32.

1. Субстратов или их аналогов:
Фермент-субстратный комплекс часто более
устойчив, чем свободный фермент.
Пример: Лактатдегидрогеназа в присутствии
лактата более термоустойчив.

33.

Стабилизация ферментов с помощью:
2. Органических растворителей:
Многоатомные спирты стабилизируют некоторые
ферменты за счет повышения устойчивости
внутримолекулярных водородных связей белка.
Пример: Химотрипсин в присутствии 50–90 %
глицерина более устойчив к протеолизу

34.

Стабилизация ферментов с помощью:
3. Солей:
При низких концентрациях солей (<0,1M) катионы
Са2+, Zn2+, Mn2+,Fe2+ и др. могут специфично
взаимодействовать с металлопротеинами.
Некоторые из них - кофакторы.
Са2+ способен стабилизировать третичную
структуру ряда белков благодаря образованию
ионных связей с двумя различными
аминокислотными остатками.
Пример: у α-Амилазы (из bacillus caldolyticus)
Са2+ значительно повышает термическую
устойчивость.

35.

36.

Химическая модификация фермента
1. Фермент принимает более стабильную
конформацию.
2. Введение в белок новых функциональных групп
приводит к образованию дополнительных
стабилизирующих водородных связей или солевых
мостиков.
3. При использовании неполярных соединений
усиливаются гидрофобные взаимодействия.
4. Модификация гидрофобных областей поверхности
белка гидрофильными соединениями уменьшает
площадь неблагоприятного контакта внешних
неполярных остатков с водой.
Пример: глутаровый альдегид

37.

Иммобилизация фермента позволяет:
Повысить устойчивость фермента (нагреванию,
автолизу, действию агрессивных сред и т. д)
1. Многократно использовать фермент
2. Отделять фермент от реагентов и продуктов
реакции.
3. Прерывать реакцию в нужный момент.

38.

Иммобилизованные ферменты – это препараты
ферментов, молекулы которых связаны с
носителем, сохраняя при этом полностью или
частично свои каталитические свойства.
Методы иммобилизации:
1. Химические
2. Физические

39.

Методы иммобилизации:
В качестве носителей могут применяться:
1)Органические материалы:
1.1) природные (полисахариды, белки, липиды)
1.2) синтетические полимерные носители
2) Неорганические материалы (матрицы на
основе силикагеля, глины, керамики, природных
минералов и т. д.)

40.

1) адсорбция фермента на нерастворимом носителе
в результате электростатических, гидрофобных,
вандер-ваальсовых и др. взаимодействий;

;

структуры;
4) Включение в двухфазную систему.

41.

Методы физической иммобилизации:

Достигается путем контакта водного раствора
фермента с носителем.

42.

Методы физической иммобилизации:
1)адсорбция фермента на нерастворимом носителе
Факторы влияющие на адсорбцию:
1. Удельная поверхность и пористость носителя
2. Значение рН (на не ионообменниках мах адсорбция
в изоэлектрической точке белка)
3. Ионная сила раствора (возрастание ионной силы –
десорбция фермента, но иногда обратная ситуация
“высаливание”)
4. Концентрация фермента.
5. Температура (с одной стороны денатурация, с
другой ускоренная диффузия)

43.

Методы физической иммобилизации:
1)адсорбция фермента на нерастворимом носителе
Преимущества:

2) Доступность носителей
Недостатки:
1) Недостаточная прочность связывания
2) Многие носители биодеградируемы

44.

Методы физической иммобилизации:
2) включение фермента в полупроницаемую
капсулу, в полупроницаемую мембрану

45.

Методы физической иммобилизации:
2) включение фермента в полупроницаемую
капсулу, в полупроницаемую мембрану
Преимущества:
1) Относительная простота методики
2) Защита от микроорганизмов
3) Нет диффузионных ограничений (т.к.
отношение поверхности к площади велико и
толщина мембраны невелика)
Недостатки:
1) Биодеградируемы
2) Не применим для высокомолекулярных

46.

Методы физической иммобилизации:
3) механическое включение фермента в гелевые
структуры
Фермент включается в трехмерную сетку
полимерных цепей, образующих гель.

47.

Методы физической иммобилизации:
3) механическое включение фермента в гелевые
структуры
Необходимо учитывать:
1. Соответствие размера пор размеру фермента.
2. Природа матрицы (т.к. она создает
микроокружение для фермента, может
создавать рН отличное от рН раствора и
повышать сродство субстрата к матрице, что
повышает скорость ферментативной реакции)

48.

Методы физической иммобилизации:
3) механическое включение фермента в гелевые
структуры
Преимущества:
1) Относительная простота методики
2) Повышенная механическая, химическая и
тепловая стойкость матриц.
3) Происходит стабилизация фермента
4) Фермент защищен от бактериального
повреждения
Недостатки:
1) Не применим для высокомолекулярных

49.

Методы физической иммобилизации:
4) Включение в двухфазную систему
Фермент растворим только в одной из фаз, а
продукт - в другой
Позволяет работать в высокомолекулярными
субстратами.

50.

Методы химической иммобилизации:
Образовании ковалентных связей между
ферментом и носителем.
Преимущества:
1) Высокая прочность конъюгата
2) Можно повышать стабильность фермента

51.

При иммобилизации ферментов необходимо
соблюдать следующие условия:
1. Активные группы матрицы не должны
блокировать каталитический центр фермента.
2. Иммобилизации не должны приводить к потере
активности фермента.

52.

Весьма перспективным является использование в
качестве биокатализаторов иммобилизованных
клеток.
Т.к. можно избежать:
1) дорогостоящие стадии выделения и очистки
ферментов
2) необходимости их последующей стабилизации

53.

Термозимы
Стабильны в условиях высокой температуры,
высоких концентраций солей и экстремальных
значений рН.
Гипертермофильные микроорганизмы,
встречающиеся среди Archaea и Bacteria, живут
при температурах 80–100 °С.

54.

Механизмы ответственны за термоустойчивость
ферментов у термозимов:
Между мезофильными и термофильными
версиями ферментов - высокая степень гомологии
последовательности и структуры.
Так, последовательности термостабильных
дегидрогеназ из Pyrococcus и Thermotoga на 35 и
55% соответственно идентичны
последовательности мезофильной дегидрогеназы
из Clostridium.

55.

Было обнаружено, что дегидрогеназа из Pyrococcus
furiosus (Tm == 105 °C) содержит 35 изолейцинов,
в то время как дегидрогеназы из Thermotoga
maritima (Tm = 95 °C) и Clostridium symbiosum (Tm
= 55 °C) только 21 и 20 изолейцинов
соответственно.
Термостабильные ферменты содержат меньше
глицина: Cs дегидрогеназа содержит 48 остатков
глицина, а дегидрогеназы из Tm и Pf только
39 и 34 глицина соответственно.
Больше изолейцина и меньше глицина.

56.

Возросшая термостабильность коррелирует:
1) с увеличением жесткости белковой структуры
за счет уменьшения содержания остатков
глицина,
2) с улучшением гидрофобных контактов в ядре
дегидрогеназы из Pf в результате замены валина
изолейцином. (В результате сайт-направленного
мутагенеза приводящего к замене изолейцина
на валин термостабильность мутантов
уменьшалась).

57.

Механизмы стабилизации:
минимизация доступной площади гидрофобной
поверхности белка;
оптимизация упаковки атомов белковой
молекулы (минимизация отношения
поверхность/объем);
оптимизация распределения зарядов (достигается
благодаря устранению отталкивающих
взаимодействий, а также в результате организации
взаимодействий между зарядами в своеобразную
сеть)
Уменьшение количества впадин

58.

Применение ферментов из экстремофилов
Современные технологии молекулярной биологии
и генной инженерии позволяет:
1) получать достаточные количества ферментов из
экстремофилов для их последующего
анализа и практического применения.
2)клонирование и экспрессия этих ферментов в
мезофильных организмах.

59.

Крахмал используется для производства сахаров.
Сначала процесс ведется при (95–105 °С) и при значениях
рН 6–6,5.
На следующем этапе температура снижается до 60°С и
рН=4,5.
Использование термостабильных ферментов (αамилазы, глюкоамилазы, ксилозоизомеразы),
выделенных из гипертермофилов, позволит:
1) проводить процесс в одну стадию и при одних и
тех же условиях
2) отказаться от дорогостоящих ионообменников

60.

Применение ферментов из экстремофилов:
Наиболее термостабильные α-амилазы были
обнаружены у archaea Pyrococcus woesei,
Pyrococcus furiosus, Desulfurococcus mucosus,
Pyrodictium abyssi и Staphylothermus
marinus. Гены амилазы из Pyrococcus sp. были
клонированы и экспрессированы в E.coli и Bacillus
subtilis.

61.

Применение ферментов из экстремофилов:
Протеолитические ферменты
Сериновые щелочные протеиназы широко
используются в качестве добавок к моющим
средствам.
Протеиназы из экстремофилов сохраняют
нативность при высоких температурах, в
присутствии высоких концентраций детергентов и
других денатурирующих агентов. Pyrococcus,
Thermococcus, Staphylothermus, Desulfurococcus и
Sulfolobus. Максимальную активность эти
ферменты проявляют при температурах
от 90 до 110 °С и значениях рН от 2 до 10

62.

Применение ферментов из экстремофилов:
ДНК-полимеразы
Термостабильные ДНК-полимеразы используются
в ПЦР и играют важную роль в генной инженерии.
Термостабильные полимеразы были обнаружены у
гипертермофилов Pyrococcus furiosus и Pyrococcus
litoralis, а также у термофилов Thermus aquaticus.