Строение и функции мембранных белков. Мембранные белки, их структура свойства и особенности Значение белков в мембранной клетки

Мембранные фосфолипиды играют роль растворителя для мембранных белков, создавая микроокружение, в котором последние могут функционировать. Из 20 аминокислот, входящих в состав белков, шесть являются в высшей степени гидрофобными из-за боковых групп, присоединенных к а-атому углерода, несколько аминокислот слабо гидрофобны, а остальные гидрофильны. Как мы видели в гл. 5, при образовании а-спирали гидрофобность самих пептидных групп минимизируется. Таким образом, белки могут образовывать единое целое с мембраной. Для этого нужно, чтобы их гидрофильные участки выступали из мембраны внутрь клетки и наружу, а гидрофобные пронизывали гидрофобную сердцевину бислоя. И в самом деле, те участки белковых молекул, которые погружены в мембрану, содержат большое количество гидрофобных аминокислот и характеризуются высоким содержанием а-спиралей или -слоев.

Таблица 42.2. Ферментные маркеры различных мембран

Число разных белков в мембране варьирует от 6-8 в саркоплазматическом ретикулуме до более чем 100 в плазматической мембране. Это ферменты, транспортные белки, структурные белки, антигены (т. е. белки, определяющие гистосовместимость) и рецепторы для разных молекул. Поскольку каждая мембрана характеризуется своим набором белков, говорить о существовании некой типичной структуры мембран нельзя. В табл. 42.2 представлены ферментативные активности, присущие некоторым типам мембран.

Мембраны являются динамическими структурами. Мембранные белки и липиды постоянно обновляются. Скорости обновления разных липидов, как и разных белков, варьируют в широком диапазоне. Сами мембраны могут обновляться даже быстрее, чем любой их компонент. Более подробно этот вопрос будет рассмотрен в разделе, посвященном эндоцитозу.

Асимметрия мембран

Асимметрия является важным свойством мембран и, по-видимому, отчасти связана с неравномерным распределением белков в мембране. Трансмембранная асимметрия может быть обусловлена и разной локализацией углеводов, связанных с мембранными белками. Кроме того, на внешней или внутренней стороне мембраны могут быть расположены какие-то специфические ферменты; это касается как митохондриальных, так и плазматических мембран.

Мембраны обладают также локальной асимметрией. В некоторых случаях (например, в щеточной каемке клеток слизистых оболочек) она проявляется почти на макроскопическом уровне. В других случаях (например, в области щелевых контактов, плотных контактов и синапсов, занимающих очень небольшую часть площади мембраны) области локальной асимметрии невелики.

Наблюдается также асимметрия в распределении фосфолипидов между наружной и внутренней сторонами мембран (поперечная асимметрия). Так, холинсодержащие фосфолипиды (фосфатидилхолин и сфингомиелин) располагаются в основном в наружном молекулярном слое, а аминофосфолипиды

(фосфатидилсерин и фосфатидилэтаноламин) - преимущественно во внутреннем. Холестерол обычно содержится в наружном слое в больших количествах, чем во внутреннем. Очевидно, что если такая асимметрия в принципе существует, то поперечная подвижность (флип-флоп) мембранных фосфолипидов должна быть ограничена. И в самом деле, для фосфолипидов в синтетических бислоях характерна исключительно низкая скорость перескоков - время существования асимметрии может измеряться днями или неделями. Однако при искусственном включении в синтетические бислои некоторых мембранных белков, например эритроцитарного белка гликофорина, частота флип-флоп-переходов фосфолипидов может возрасти в сотню раз.

Механизмы асимметричного распределения липидов пока не установлены. Участвующие в синтезе фосфолипидов ферменты локализованы на цитоплазматической стороне мембран микросомных везикул. Таким образом, можно предположить, что существуют транслоказы, переносящие определенные фосфолипиды от внутреннего слоя к наружному. Кроме того, в обоих слоях могут присутствовать специфические белки, преимущественно связывающие те или иные фосфолипиды и приводящие к их асимметричному распределению.

Интегральные и периферические мембранные белки

Большинство мембранных белков являются интегральными компонентами мембран (они взаимодействуют с фосфолипидами); почти все достаточно полно изученные белки имеют протяженность, превышающую 5-10 нм, - величину, равную толщине бислоя. Эти интегральные белки обычно представляют собой глобулярные амфифильные структуры. Оба их конца гидрофильны, а участок, пересекающий сердцевину бислоя, гидрофобен. После установления структуры интегральных мембранных белков стало ясно, что некоторые из них (например, молекулы белков-переносчиков) могут пересекать бислой многократно, как это показано на рис. 42.7.

Интегральные белки распределены в бислое асимметрично (рис. 42.8). Если мембрану, содержащую асимметрично распределенные интегральные белки, растворить в детергенте, а затем детергент медленно удалить, то произойдет самоорганизация фосфолипидов и интегральных белков и сформируется мембранная структура, но белки в ней уже не будут специфическим образом ориентированы. Таким образом, асимметричная ориентация в мембране по крайней мере некоторых белков может задаваться при их включении в липидный бислой. Наружная гидрофильная часть амфифильного белка, которая, конечно, синтезируется внутри клетки, должна затем пересечь гидрофобный слой мембраны и в конечном итоге оказаться снаружи.

Рис. 42.7. Предполагаемая модель переносчика глюкозы у человека. Предполагается, что переносчик пересекает мембрану 12 раз. Пересекающие мембрану участки могут образовывать амфифильные а-спирали с амидной и гидроксильной боковыми группами и, по-видимому, связывают глюкозу или образуют канал для ее переноса. Амино - и карбоксильный концы цепи находятся на цитоплазматической поверхности. (Из работы Mueckler et al.: Sequence and structure of a human glucose transporter. Science, 1985. 229, 941, с любезного разрешения.)

Молекулярные механизмы организации мембран мы обсудим позже.

Периферические белки не взаимодействуют с фосфолипидами в бислое непосредственно; вместо этого они образуют слабые связи с гидрофильными участками специфических интегральных белков. Например, анкирин, периферический белок, связан с интегральным белком полосы III эритроцитарной мембраны. Спектрин, образующий скелет мембраны эритроцита, в свою очередь связан с анкирином и, таким образом, играет важную роль в поддержании двояковогнутой формы эритроцита. Молекулы иммуноглобулина являются интегральными белками плазматической мембраны и высвобождаются только вместе с небольшим фрагментом мембраны. Интегральными белками являются многие рецепторы различных гормонов, и специфические полипептидные гормоны, связывающиеся с этими рецепторами, можно, таким образом, считать периферическими белками. Такие периферические белки, как пептидные гормоны, могут даже детерминировать распределение в плоскости бислоя интегральных белков - их рецепторов (см. ниже).

1. ТРАНСПОРТ ГИДРОФИЛЬНЫХ МОЛЕКУЛ, и, в частности, заряженных частиц. Например, транспорт ионов натрия и калия осуществляется K,Na-насосом.

2. ФЕРМЕНТАТИВНАЯ РОЛЬ.

Ферменты, заключенные в мембрану, обладают рядом особенностей каталитических свойств. У этих ферментов особая чувствительность к факторам окружающей среды.

РЕЦЕПТОРНАЯ РОЛЬ. Взаимодействие с гормонами, медиаторами осуществляется мембранными белками-гликопротеинами. Самостоятельно углеводный компонент не участвует в построении мембраны, но липиды и белки содержат углеводы.

Роль углеводных компонентов мембран

а) Участвуют в рецепции.

б) Обеспечивают взаимодействие клеток друг с другом.

в) Некоторые углеводные компоненты обеспечивают антигенную специфичность клеток. Например, эритроциты разных групп крови отличаются друг от друга по составу углеводных компонентов.

Мембраны асимметричны. 2 монослоя отличаются друг от друга по своему составу. Например, гликолипиды плазматической мембраны всегда находятся в наружном монослое. Асимметрия характерна и для белковых компонентов.

Аденилатциклаза. Ее активный центр находится на внутренней части мембраны. Белки-рецепторы свой углеводный компонент содержат с внешней стороны мембраны.

Важнейшим компонентом плазматических мембран является холестерин.

Холестерин взаимодействует с гидрофобными хвостами полярных молекул и ограничивает скорость диффузии липидов. Поэтому холестерин называют стабилизатором биологических мембран. Компоненты мембран не только движутся в пространстве, но и постоянно обновляются. Их место занимают новые молекулы.

В учебную программу входит только обмен ГФЛ и холестерина. Липоиды синтезируются на мембранах эндоплазматического ретикулума. Наблюдается постоянное передвижение липоидов от мембран ЭПС к другим мембранам.

СИНТЕЗ ХОЛЕСТЕРИНА

Протекает в основном в печени на мембранах эндоплазматического ретикулума гепатоцитов. Этот холестерин - эндогенный. Происходит постоянный транспорт холестерина из печени в ткани. Для построения мембран используется также пищевой (экзогенный) холестерин. Ключевой фермент биосинтеза холестерина - ГМГ-редуктаза (бета-гидрокси, бета-метил, глутарил-КоА редуктаза). Этот фермент ингибируется по принципу отрицательной обратной связи конечным продуктом - холестерином.

ТРАНСПОРТ ХОЛЕСТЕРИНА.

Пищевой холестерин транспортируется хиломикронами и попадает в печень. Поэтому печень является для тканей источником и пищевого холестерина (попавшего туда в составе хиломикронов), и эндогенного холестерина.

В печени синтезируются и затем попадают в кровь ЛОНП - липопротеины очень низкой плотности (состоят на 75% из холестерина), а также ЛНП - липопротеины низкой плотности(в их составе есть апобелок апоВ 100 .

Почти во всех клетках имеются рецепторы для апоВ 100 . Поэтому ЛНП фиксируются на поверхности клеток. При этом наблюдается переход холестерина в клеточные мембраны. Поэтому ЛНП способны снабжать холестерином клетки тканей.

Помимо этого, происходит и освобождение холестерина из тканей и транспорт его в печень. Транспортируют холестерин из тканей в печень липопротеины высокой плотности (ЛВП). Они содержат очень мало липидов и много белка. Синтез ЛВП протекает в печени. Частицы ЛВП имеют форму диска, и в их составе находятся апобелки апоА, апоС и апоЕ . В кровеносном русле к ЛНП присоединяется белок-фермент лецитинхолестеринацилтрансфераза (ЛХАТ) (смотрите рисунок).

АпоС и апоЕ могут переходить от ЛВП на хиломикроны или ЛОНП. Поэтому ЛВП являются донорами апоЕ и апоС. АпоА является активатором ЛХАТ.

ЛХАТ катализирует следующую реакцию:

Это реакция переноса жирной кислоты из положения R 2 на холестерин.

Реакция является очень важной, потому что образующийся эфир холестерина является очень гидрофобным веществом и сразу переходит в ядро ЛВП - так при контакте с мембранами клеток ЛВП удаляют из них избыток холестерина. Дальше ЛВП идут в печень, там разрушаются, и избыток холестерина удаляется из организма.

Нарушение соотношения между количеством ЛНП, ЛОНП и ЛВП может вызывать задержку холестерина в тканях. Это приводит к атеросклерозу. Поэтому ЛНП называют атерогенными липопротеинами, а ЛВП - антиатерогенными липопротеинами. При наследственном дефиците ЛВП наблюдаются ранние формы атеросклероза.

Нажав на кнопку "Скачать архив", вы скачаете нужный вам файл совершенно бесплатно.
Перед скачиванием данного файла вспомните о тех хороших рефератах, контрольных, курсовых, дипломных работах, статьях и других документах, которые лежат невостребованными в вашем компьютере. Это ваш труд, он должен участвовать в развитии общества и приносить пользу людям. Найдите эти работы и отправьте в базу знаний.
Мы и все студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будем вам очень благодарны.

Чтобы скачать архив с документом, в поле, расположенное ниже, впишите пятизначное число и нажмите кнопку "Скачать архив"

Подобные документы

Структура биологических мембран и строение их основы - билипидного слоя. Молекулярная масса мембранных белков, их различие по прочности связывания с мембраной. Динамические свойства биологических мембран и значение организации для биологических систем.

реферат , добавлен 20.12.2009


Строение мембран. Мембраны эритроцитов. Миелиновые мембраны. Мембраны хлоропластов. Внутренняя (цитоплазматическая) мембрана бактерий. Мембрана вирусов. Функции мембран. Транспорт через мембраны. Пассивный транспорт. Активный транспорт. Ca2+ –насос.

реферат , добавлен 22.03.2002


Белки и липиды как основные компоненты мембран. Фосфолипидный состав субклеточных мембран печени крысы. Длинные углеводородные цепи. Мембраны грамположительных бактерий. Пути биосинтеза мембранных липидов и механизмы их доставки к местам назначения.

реферат , добавлен 30.07.2009


Изобилие и сложность строения внутренних мембран как одна из основных особенностей всех эукариотических клеток. Понятие, свойства и функции мембран: барьерная, транспортная. Сущность и назначение ионных и кальциевых каналов, способы из исследования.

реферат , добавлен 19.10.2014


Функции биологических мембран и их компонентов. Спектроскопические методы измерения скорости вращения липидов и белков внутри мембраны и скорости латеральной диффузии этих компонентов в плоскости мембраны. Использование спиновых или флуоресцентных зондов.

реферат , добавлен 01.08.2009


Разнообразие и роль мембран в функционировании прокариотических и эукариотических клеток. Морфология мембран, их выделение. Дифракция рентгеновских лучей, электронная микроскопия. Разрушение клеток, разделение мембран. Критерии чистоты мембранных фракций.

курсовая работа , добавлен 30.07.2009


Ультраструктура биологических и молекулярное строение цитоплазматических мембран, их основные функции. Физическая природа сил взаимодействия белков и липидов в их структурах. Методы изучения и исследования искусственных моделей цитоплазматических мембран.

: характеристика и структурные принципы

1. Структура мембранных белков

Основная роль липидов в составе мембран заключается в стабилизации бислойной структуры, а белки являются активными компонентами биомембран. Мы обсудим некоторые принципы, оказавшиеся полезными для выяснения структурных особенностей мембранных белков. Мы приведем примеры, иллюстрирующие эти принципы.

На заре развития мембранологии полагали, что мембранные белки по своей структуре довольно гомогенны и уложены в виде 3-слоев по поверхности бислоя. Сейчас скорее склонны считать, что по крайней мере у трансмембранных белков те их участки, которые погружены в мембрану, содержат а-спирали. Конечно, очень хотелось бы сделать какие-то однозначные выводы по этому поводу, но они должны основываться на фактических данных. Перед лицом огромного структурного разнообразия растворимых белков приходишь к заключению, что интегральные мембранные белки могут оказаться гораздо сложнее, чем мы сейчас представляем. Классификация растворимых белков по типам структур была проведена только после того, как установили с высоким разрешением структуру более 100 различных белков. Что касается трансмембранных белков, то это удалось сделать только в одном случае - для белка фотосинтетического реакционного центра бактерий. Вместе с электронно-микроскопическими данными низкого разрешения о структуре бактериородопсина это единственный источник, на котором может основываться построение моделей для большинства других трансмембранных белков.

Еще один важный момент - способы прикрепления белков к мембране. Они схематически представлены на рис. 3.1.

1. Связывание с белками, погруженными в бислой. В качестве примеров можно привести Fi-часть Н + -АТРазы, которая связывает ся с Fo-частью, погруженной в мембрану; можно упомянуть также некоторые белки цитоскелета.

2. Связывание с поверхностью бислоя. Это взаимодействие имеет в первую очередь электростатическую природу или гидрофобную. На поверхности некоторых мембранных белков имеются гидрофобные домены, образующиеся благодаря особеностям вторичной или третичной структуры. Указанные поверхностные взаимодействия могут использоваться как дополнение к другим взаимодействиям, например к трансмембранному заякориванию.

3.Связывание с помощью гидрофобного «якоря»; эта структура обычно выявляется как последовательность неполярных аминокислотных остатков. Некоторые мембранные белки используют в качестве якоря кова-лентно связанные с ними жирные кислоты или фосфолипиды.

4.Трансмембранные белки. Одни из них пересекают мембрану только один раз, другие - несколько раз.

Различиями между наружными и внутренними мембранными белками не задается однозначно способ их прикрепления к бисЛою; эти различия определяют лишь относительную силу их связывания.




2. Очистка мембранных белков

Для очистки интегральных мембранных белков и получения их в биохимически активной форме необходимы детергенты, позволяющие солюбилизировать белки и сохранить их в растворе. Соответствующие требования к детергентам и правилам обращения с ними создают дополнительные проблемы помимо тех, с которыми обычно сталкиваются при очистке белков. Для выделения интегральных мембранных белков разработано много специальных методов, однако большинство схем очистки основано на тех же хроматографических и гидродинамических методиках, которые используются для растворимых белков. Это хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе, сефарозе или гидроксила-патите, гель-фильтрация, центрифугирование в градиенте плотности сахарозы и т. д. Очень важен правильный выбор детергента, поскольку именно детергент разрушает биомембрану, занимая место липидов, окружающих тот или иной белок, и определяет стабильность белка в растворе. Механизмы действия детергентов рассмотрены в обзоре.

2.1. ДЕТЕРГЕНТЫ

В течение последних двух десятилетий появилось очень много детергентов, пригодных для очистки интегральных мембранных белков. В принципе нужно пытаться найти такой детергент, который не нарушал бы вторичную и третичную структуры мембранных белков, а лишь замещал бы большинство или все мембранные липиды, контактирующие с гидрофобными участками белковой молекулы. Конечной целью солюбилизации является встраивание белка в детергентиую мицеллу; последующая стратегия очистки состоит в разделении таких белково-детергентных комплексов.

Первая проблема - это подбор оптимальных условий солюбили-зации изучаемого белка. Детергенты, денатурирующие белки, не подходят для решения такой деликатной задачи. С другой стороны, многие детергенты недостаточно эффективно разрушают мембраны и образуют белоксодержащие смешанные мицеллы. Такие детергенты могут быть либо слишком гидрофобными, либо слишком гидрофильными для эффективного смешивания с мембранными липидами и - при достаточно высокой их концентрации - для превращения бислоя в глобулярные смешанные мицеллы. Сначала надеялись, что выбор необходимого детергента удастся систематизировать с помощью одного параметра, называемого гидро-фильно-липофильным балансом. Этот параметр, изменяющийся от 1 до 20, используется при получении сурфактантов в качестве меры относительной гидрофобности. Действительно, получены некие корреляции, из которых следует, что значение ГЛБ детергента может использоваться для предсказания его поведения в биологических системах. Вообще говоря, можно сказать, что детергенты со значением ГЛБ в диапазоне от 12,5 до 14,5 являются наиболее эффективными растворителями интегральных мембранных белков. Однако впоследствии выяснилось, что поиск оптимальных детергентов для определенного мембранного белка требует учета многих факторов и всегда должен сопровождаться эмпирической проверкой. Необходимо учитывать следующее.

1.Максимальная солюбилизация исследуемого белка. Критерием является переход белка в супернатант после центрифугирования, при котором происходит осаждение мембраны.

2.Солюбилизация белка в нужной форме. Обычно речь идет о сохранении его ферментативной активности, но иногда используются определенные спектральные характеристики или наличие конкретных белковых ассоциатов. Кроме того, необходимым условием является стабильность белка после солюбилизации. В некоторых случаях для поддержания биохимической активности вместе с детергентом добавляют экзогенные фосфолипиды. В качестве примера можно привести получение лактозопермеазы Е. coliи белка натриевого канала. Иногда для стабилизации белка после солюбилизации добавляют глицерол или другой полиол. Имеет смысл использовать также ингибиторы протеаз и проводить солюбилизацию в условиях, сводящих к минимуму вероятность их протеолитического расщепления.

3.Возможность использования детергента в данной методике. Необходимо прежде всего учитывать заряд детергента, поведение при данном значении рН, ККМ и размер мицелл детергента. Последние свойства особенно важны. Детергенты с низкой ККМ, образующие крупные мицеллы, не удаляются при диализе или ультрафильтрации из-за слишком низкой концентрации мономеров детергента. С практической точки зрения это означает, что если концентрировать белок с помощью ультрафильтрации, то будет возрастать и концентрация детергента с низкой ККМ, а это может привести к денатурации белка. По этой причине многие исследователи предпочитают использовать детергенты с высокими ККМ, например октилглюкозид, соли желчных кислот или более современные цвиттерионные детергенты. Весьма ценными являются полистиреновые смолы, такие, как биобидз SM-2. Они избирательно связываются с детергентами типа тритон Х-100, удаляют их из раствора и позволяют обойтись вообще без диализа. Еще один фактор, который необходимо учитывать, - это поглощение света детергентом. Некоторые детергенты, например тритон Х-100, поглощают в ближней УФ-области, что делает невозможным определение концентрации белка по измерению оптической плотности при длине волны 280 нм.

С учетом всех этих факторов становится понятно, почему во многих случаях при выделении интегральных мембранных белков приходится использовать разные детергенты. Например, для солюбилизации можно применять тритон Х-100, а разделение с помощью ДЭАЭ-целлюлозы лучше проводить в присутствии октилглюкозида. Детергенты можно менять на стадии хроматографии, во время центрифугирования в градиенте плотности, а в некоторых случаях - с помощью диализа. Следует иметь в виду, что детергент, непригодный для солюбилизации определенного белка, может быть очень эффективным для сохранения белка в растворе после замены детергента. Очистку почти всегда следует проводить при избытке детергента в растворе, в противном случае равновесие будет сдвинуто в сторону агрегации мембранных белков, а не в сторону образования белково-детергентных комплексов. В некоторых случаях подобная агрегация может быть даже желательна, и последняя стадия очистки может состоять в удалении детергента. Но, как правило, при недостатке детергента происходят необратимое осаждение и потеря белка.

Необходимость поддержания концентрации детергента на определенном уровне создает дополнительнее трудности помимо тех, с которыми обычно сталкиваются при очистке белков; о некоторых из них мы уже говорили. Проблемы возникают и при использовании стандартного метода высаливания при высокой концентрации сульфата аммония: во многих случаях белок осаждается в комплексе с детергентом и липидом. Поскольку солевой раствор имеет высокую плотность, а детергент в агрегате - относительно низкую, то при центрифугировании преципитат будет оставаться на поверхности. Важно помнить, что очистке подвергаются белково-детергентные комплексы, нередко со значительным количеством связанного фосфолипида. Это сказывается на качестве разделения при хроматографировании, а также на результатах характеристики конечного прорастворимых белков, нужно определить число и молекулярную массу полипептидных субъединиц, их стехиометрию, размер и, возможно, форму молекулы, а также, если это необходимо, биохимическую активность.




Детергент 1 В табл. 1 и 2 перечислены наиболее широко используемые детергенты и указаны их свойства, важные для обсуждаемых нами вопросов. Эмпирически наиболее эффективными являются: 1) неионные детергенты (тритон Х-100, октилглюкозид); 2) соли желчных кислот (холат, дезоксихолат); 3) цвиттерионные детергенты (CHAPS, цвнттергент). Но выбор детергента, наиболее приемлемого для солюбилизации и очистки определенного мембранного фермента, по-прежнему осуществляется методом проб и ошибок.	ККМ, мМ	Мол.масса	1 Размер А мнцеллы	.грегационис число	х Удельный объем, мл/г	Ссылки
Долецилсульфат	1,33	288	24 500	85	0,864
натрия
Холат натрия "	3	408	2100	5	0,778	(612, 1383]
Дезоксихолат	0,91	392	23 000	55	0,771
натрия "
0,11	538	68 000	12	0,973
Тритои Х-100 2)	0,24	628	90 000	140	0,908
Твин 80 2)	0,012	1300	76 000	60	0,8%
Лаурилдиметил-	2,2	229	17 000	75	1,112	|612]
аминоксид
^-D-Октил-	25	293	8000	27	0,820
^-D-Лаурил-	0,16	510	50 000	98	0,820
мальтозид
CHAPS	8	615	6150	10	0,802
Цвиттергеит	3,6	335	-	-	0,957




3. ХАРАКТЕРИСТИКА ОЧИЩЕННЫХ ИНТЕГРАЛЬНЫХ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ

Характеристика очищенных мембранных белков, даже самых простых, может составлять определенные трудности. Как и в случае

3.1 МОЛЕКУЛЯРНАЯ МАССА СУБЪЕДИНИЦ

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецил-сульфата натрия - это обычная методика, но в случае интегральных мембранных белков при ее применении возникают особые проблемы. В этом методе додецилсульфат связывается с полипептидными цепями, и комплексы белок-ДНС разделяются в полиакриламидном геле в соответствии с их стоксовыми радиусами, которые в большинстве случаев зависят от молекулярной массы. Молекулярную массу определяют, сравнивая электрофоретическую подвижность данного комплекса и известного стандарта. Однако связывание ДСН с неизвестным белком может качественно отличаться от связывания со стандартами, и тогда будет получен неправильный результат. Подобная ситуация наблюдается для интегральных мембранных белков с высоким содержанием неполярных аминокислотных остатков. С большинством растворимых белков ДСН образует комплексы в соотношении 1,4 г ДСН на 1 г белка, а с белками, содержащими большой процент неполярных остатков, может связываться больше детергента. Возникающий при этом дополнительный отрицательный заряд приводит к аномальному повышению электрофоретической подвижности, и определяемая молекулярная масса оказывается меньше, чем на самом деле. Возможна и другая ситуация. Связывающийся с ДСН мембранный белок может находиться в не полностью развернутом состоянии, что тоже приведет к аномальному повышению электрофоретической подвижности из-за образования более компактного комплекса белок-ДСН. Все эти эффекты весьма существенны. Например, лактозопермеаза имеет кажущуюся мол. массу 33 ООО, если измерять ее с помощью электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН; в действительности же, как показывают результаты генетического анализа, ее мол. масса равна 46 ООО. Во многих случаях удается оценить молекулярную массу более точно, если построить график Фергюсона, представляющий собой зависимость электрофоретической подвижности от содержания акриламида как для стандартных белков, так и для исследуемого белка. Этот график зависит от радиуса Стокса и в меньшей степени - от заряда комплекса. Например, по результатам электрофореза в 12%-ном акриламидном геле одна из субъединиц цитохромно- г о комплекса Е. coliимеет кажущуюся мол. массу 28 ООО, а из графика Фергюсона получается величина 43 ООО, что совпадает с мол. массой, рассчитанной по данным о секвенировании соответствующей ДНК.

Еще одна проблема - возможное наличие четвертичной структуры. Некоторые мембранные белки агрегируют даже в присутствии ДСН. Например, гликофорин А или белок оболочки бактериофага М13 при электрофорезе в полиакриламидных гелях с ДСН находятся в основном в виде димеров. Иногда агрегация еще более усиливается при нагревании смеси белок-ДСН. Такая картина наблюдается, например, для субъединиц как митохондри-альной, так и бактериальной терминальных оксидаз. Чтобы оценить способность белка к необратимой агрегации, следует провести сравнительный анализ результатов электрофореза в полиакрила-мидном геле с ДСН для прогретых и непрогретых проб. Сходная проблема иногда возникает из-за присутствия детергента, использованного при очистке мембранного белка. Этот детергент необходимо удалить и заменить на ДСН, поскольку в некоторых случаях наблюдается четкая зависимость электрофоретической подвижности от присутствия детергента, с помощью которого солюбилизнровали фермент.

Итак, есть основания думать, что оценка молекулярной массы субъединиц сильно неполярных интегральных мембранных белков, определенная с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН, может оказаться неверной. К несчастью, простая альтернатива этому методу отсутствует, и правильную величину часто получают либо по данным о полной первичной последовательности, либо с помощью точного гидродинамического анализа.

3.2 ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ НАТИВНОГО БЕЛКА С ПОМОЩЬЮ ГИДРОДИНАМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

Применение этих методов для мембранных белков может быть сопряжено с большими трудностями, вызванными связыванием детергента. Чтобы оценить это в полной мере, рассмотрим вначале простой растворимый белок, для которого установлена мол. масса субъединиц с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН и необходимо узнать, чем он является в неденатурированной, активной форме - мономером, димером или олигомером более высокого порядка. Для определения молекулярной массы белков часто используется гель-фильтрация, включающая сравнение со стандартными белками; здесь возникают проблемы, связанные с тем, что все стандартные белки имеют глобулярную форму, а исследуемый белок может быть не глобулярным, а слегка удлиненным. Такой белок с мол. массой 50 000 может элюировать со скоростью, соответствующей мол. мае

се 100 ООО. В связи с этим колонка для гель-фильтрации должна быть прокалибрована в соответствии со значениями радиуса Стокса, т. е. с размерами «эквивалентной гидродинамической сферы», а кроме того, параллельно необходимо использовать какой-либо другой метод. Обычно измеряют скорость седиментации с помощью либо аналитического ультрацентрнфугирования, либо центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Коэффициент седиментации равен



где м - молекулярная масса белка,

v - его парциальный удельный объем, ij - вязкость раствора, б - плотность раствора.

Поскольку е и Ч известны, aRcможно определить с помощью гель-фильтрации, остаются только две неизвестные величины - v и м. Для водорастворимых белков v можно вычислить исходя из аминокислотного состава или непосредственно измерить либо просто принять равным 0,72-0,75 мл/г. Таким образом, измерив S 0 , можно найти м.

Рассмотрим теперь ситуацию с мембранным белком. Здесь возникают дополнительные проблемы, поскольку гидродинамическая частица - это белково-детергентный комплекс, поэтому м и v в данном случае являются молекулярной массой и удельным объемом комплекса, М к и К,. К сожалению, К, нельзя оценить, не зная ничего о составе комплекса. В этом случае для нахождения молекулярной массы белка используют два метода.

1.Прямо измеряют количество связанного детергента на 1 г белка. Для этого используют спектральные методы или радиоактивно меченный детергент, а для выделения комплексов применяют различные методы, например гель-фильтрацию. Установив относительное содержание белка и детергента в комплексе, значение К, получают как средневзвешенное соответствующих величин для чистого белка и чистого детергента. После этого без труда находят м„ а поскольку соотношение между белком и детергентом в комплексе известно, находят молекулярную массу белка.

2.Измеряют S 0 в средах с разными значениями плотности раствора д. Такие среды обычно получают, используя смеси НгО и D2O. Из графика зависимости S° от qнаходят как Л/„ так и v t . При этом предполагается, что К, - это средневзвешенное соответствующих величин для чистого белка и чистого детергента.




ОцеНИВ Квело* и взяв детергент из таблиц, получают молекулярную массу белковой составляющей м,.

Для построения графика зависимости 5° от qпроводят аналитическое центрифугирование. Можно проводить центрифугирование и в градиенте плотности сахарозы, используя смеси Н2О и D2O, но анализ результатов в этом случае гораздо сложнее, хотя принципиально не отличается от предыдущего случая.

Альтернативный способ определения молекулярной массы нативной формы мембранного белка состоит в равновесном ультрацентрифугировании. Распределение вещества в состоянии равновесия таково, что наклон графика зависимости логарифма концентрации от г 2 равен



где г - расстояние от центра ротора до данной точки в центрифужной пробирке, W- частота вращения.

Если величина У известна или ее легко оценить, как для большинства растворимых белков, эта задача решается достаточно просто. Что касается мембранных белков, то в этом случае определяют на-

Таблица 3. Связывание детергентов с некоторыми мембранными белками

клон указанной прямой при разных значениях q, получаемых смешиванием НгО и D2O. Как и ранее, одновременно находят М к и К, и далее определяют молекулярную массу белка.

Если в комплексе присутствует третий компонент, возникают дополнительные проблемы. В любом случае все описанные процедуры весьма сложны и могут давать ошибочные результаты. Количество детергента, связанного с очищенными интегральными мембранными белками, может быть весьма существенным - от 0,3 до 1,5 от массы белка, и даже небольшие ошибки в этой величине приведут к значительному искажению молекулярной массы белка. В табл. 3.3 приведены данные о количестве детергентов, присутствующих в некоторых белковых препаратах. Заметим, что растворимые белки с этими детергентами не связываются; это опять свидетельствует о том, что за связывание с детергентом ответственна именно неполярная часть белка, обычно контактирующая с мембранными липидами.

3.3 МЕТОД РАДИАЦИОННОЙ ИНАКТИВАЦИИ

Метод радиационной инактивации для определения размера мишени все чаще применяется при исследовании мембранных белков. Изучать можно как очищенные белки, так и неочищенные препараты, в том числе интактные биомембраны. Суть метода состоит в определении доли белковых молекул, получающих повреждения при облучении. Для этого используют ферментативные методы связывания гормонов или других лигандов или спектральные методы. Процедура состоит в следующем. Образец, обычно замороженный, подвергают высокоэнергетическому облучению. Через разные промежутки времени отбирают пробы, размораживают их и проводят измерения. Повреждения белка под действием излучения выявляют, например, с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН. Как показывает опыт, некоторые субъединицы полностью утрачивают биологическую активность при внесении радиационного повреждения в любое место полипептидной цепи. Ключевым моментом является то, что, чем крупнее белковая молекула, тем больше вероятность ее повреждения и, следовательно, вероятность инактивации. Эта вероятность зависит не от формы молекулы, а от ее массы. Обычно для того, чтобы облегчить интерпретацию результатов, параллельно облучают белок с известной молекулярной массой. Если исследуемый белок содержит более одной субъединицы, возникают определенные трудности при анализе результатов. Повреждение одной субъединицы не обязательно сопровождается разрывом ковалентных связей в других субъединицах. Поэтому для ферментов, состоящих из разных субъединиц, обладающих неодинаковыми активностями, могут быть получены разные размеры мишени в зависимости от метода определения степени инактивации.

Примечательной особенностью метода является то, что его можно использовать для изучения интегральных мембранных белков insitu. Возникающие при этом артефакты и проблемы рассмотрены в работе. Одна из очевидных проблем - необходимость использования высокоэнергетического излучения. В связи с этим большинство работ приходится проводить в сотрудничестве с лабораториями, в которых имеются соответствующие источники и освоены специальные методы анализа.




3.4 СПЕКТРАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ И ВТОРИЧНАЯ СТРУКТУРА

Для определения содержания а-спиралей и /3-слоев в мембранных белках используют несколько методов. В отсутствие трехмерной организации на их основе можно попытаться построить соответствующие модели. Чаще всего используется метод кругового дихроизма. Все более широкое применение находят инфракрасная и рамановская спектроскопия, а также ЯМР.

1. Метод кругового дихроизма основан на измерении разности поглощения лево- и правополяризованного света; эта оптическая активность является мерой хиральности молекул, или мерой их асимметрии. В дальней ультрафиолетовой области КД определяется в основном поглощением амидов карбонильных групп полипептидного остова. При наличии участков вторичной структуры, например а-спиралей, спектр КД имеет вполне определенные особенности, связанные с особенностями электронного окружения амидиых групп в этих структурах. Анализизуя спектр КД белков, его обычно представляют как сумму компоиеитов, отвечающих поглощению разных участков белковой молекулы: а-спиралей, /3-слоев и случайных клубков. Определив тем или иным способом спектры каждой из этих структур, производят их суммирование, подбирая соответствующие коэффициенты таким образом, чтобы было достигнуто наилучшее соответствие измеренному спектру. Подобранные весовые коэффициенты представляют собой ту долю, которая приходится в молекуле на каждый из типов вторичной структуры.

Эти методы были разработаны для растворимых белков, но нет никаких оснований сомневаться, что их можно с успехом применять и для мембранных белков. Скорее всего у последних имеются участки с такими же типами вторичной структуры, как и у растворимых белков, и при их изучении возникнут такие же трудности. Некоторые белки можно изучать insitu, используя суспензии мембран. Примерами такого рода являются бактериородопсин из пурпурной мембраны Halobacteriumhalobiumи Са 2 + -АТРаза из мембраны саркоплазмати-ческого ретикулума. Очищенные мембранные белки можно исследовать с помощью КД и в присутствии детергентов, если поглощение последних в дальней УФ-области не слишком велико, или в составе реконструированных везикул. Здесь возникают две проблемы: 1) дифференциальное светорассеяние, когда размер мембранных частиц гораздо больше длины волны света; 2) выравнивание поглощения из-за концентрирования белка в мембранах или везикулах, т. е. из-за негомогенности его распределения в растворе. Эти артефакты могут быть весьма существенными, однако их можно учесть с помощью соответствующих методов.

К сожалению, для внутренних мембранных белков отсутствуют структурные данные высокого разрешения, поэтому точная интерпретация спектров КД невозможна. За исключением нескольких случаев, разные спектральные методы не использовались для изучения одного и того же белка и количественное сравнение результатов не проводилось. Интересно, что для бактериородопсина, который исследовали методами КД, ИК и ЯМР, во всех трех случаях были получены одинаковые результаты, свидетельствующие о значительном содержании в этом белке 3-слоев. Тем не менее у каждого метода имеются существенные недостатки. Так, данные о высоком содержании в бактериородопсине Д-слоев в значительной мере зависят от способа учета оптических артефактов. Судя по данным электронно-микроскопической реконструкции, харатеризующимся относительно низким разрешением, в бактериородопсине 80% приходится на долю а-спира-лей, а 0-слои отсутствуют совсем. Чтобы понять причину этих несоответствий, необходимо провести структурный анализ белка с атомным разрешением. Имеются еще два белка, пронизывающие мембрану, с высоким содержанием, и а-токсин Staphylococcusaureus. Оба этих белка участвуют в образовании пор в бислое.

2. Инфракрасная спектроскопия и спектроскопия комбинационного рассеяния. Эти методы не только позволяют получить сведения о конформации мембранных липидов, но и могут использоваться для исследования вторичной структуры белков. Колебательный спектр полипептидного остова зависит от типа вторичной структуры и дает информацию о содержании в молекуле а- и /3-структур. Этими методами можно исследовать высушенные на воздухе пленки, водные суспензии мембран, а также очищенные белки как в присутствии детергента, так и в составе реконструированных везикул. Например, по данным ИК-спектроскопии с преобразованием Фурье комплекс Са 2 + -АТРазы в мембране состоит в основном из а-спиральных участков и участков, имеющих кон-формацию статистического клубка, а гидрофобный белок миелин в реконструированных везикулах имеет как а-, так и /3-участки.

3. ЯМР-спектроскопия также может использоваться для изучения мембранных белков. Однако возможности метода в этом случае ограничены, что связано главным образом с относительно медленными движениями интегральных мембранных белков insitu и в комплексах с детергентом. Поэтому такой мощный метод, как двумерный ЯМР, который может дать детальную картину конформацион-ного состояния сравнительно небольших белков в растворе, пока непригоден для изучения мембранных белков. Более приемлем метод ЯМР твердых образцов. Большими возможностями обладают методы 2 Н- и |3 С-ЯМР, хотя до сих пор они применялись не очень широко. Получены данные об усредненной конформации остова и динамике боковых цепей. Следует отметить, что методы ЯМР твердого состояния не только не используются широко, но в большинстве случаев их и нельзя использовать. Тем не менее в тех редких ситуациях, когда их применение оказывается возможным, они являются очень ценными.

3.5 ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ

Одним из наиболее важных методов характеристики очищенных мембранных белков несомненно является определение биохимической активности. При этом используются в основном такие же критерии, как и для растворимых белков, но могут возникать и свои трудности. Первая из них связана с тем, что биохимическая активность мембранных белков часто очень сильно зависит от связывания с белком липидов и детергентов. Потеря активности может быть как обратимой, так и необратимой. Целесообразно иметь какую-то оценку удельной активности исследуемого белка invivo или в составе мембран до солюбилизации. Избыток детергента может оказывать ингибирующий эффект, например за счет разбавления неполярных субстратов в популяции мицелл и уменьшения ферментативной активности. Измеряя активность любого мембранного белка, необходимо иметь в виду, что insitu он находится в окружении липидов, обеспечивающих оптимальную активность. Вторая проблема связана с белками, обладающими «трансбислойной» активностью; примерами могут служить белки, образующие каналы, и транспортные белки. В этих случаях необходимо учитывать перемещение растворенных веществ из одного компартмента в другой.

3.6 ЧЕТВЕРТИЧНАЯ СТРУКТУРА И ХИМИЧЕСКОЕ СШИВАНИЕ

Многие мембранные ферменты представляют собой комплексы, состоящие из нескольких субъединиц. В качестве примера можно привести Н + -АТРазу, Na + /К + -АТРазу, митохондриальные комплексы электронного транспорта и фотосинтетические реакционные центры. Некоторые интегральные мембранные белки прочно связаны с растворимыми белками с помощью нековалентных взаимодействий. В Е. coliFo-компонент, содержащий по данным электрофореза в ПААГ-ДСН три типа субъединиц, образует протонный канал, aFi, состоящий из пяти типов субъединиц, содержит активный центр, участвующий в гидролизе АТР. Для таких белков очень важно определить характер субъединиц, стехиометрию комплекса и ближайшие взаимодействия его компонентов. Это весьма непростая задача даже тогда, когда белковый комплекс уже изолирован. Возникающие здесь проблемы по существу не отличаются от таковых для растворимых белковых комплексов, но имеются и свои дополнительные сложности.

Прежде всего следует иметь в виду, что взаимодействие между субъеднницами очень сильно зависит от типа липидов и детергентов, с которыми связаны белки. Например, сукцинатде-гидрогеназа Е. coliпри солюбилизации ее с помощью луброла РХ представляется состоящей из четырех субъединиц, а при солюбилизации большинством других детергентов, в том числе тритоном Х-100, - только из двух. Известно, что оперон sdhкодирует все четыре полипептида, а форма из двух субъединиц имеет аномальный спектр ЭПР. Таким образом, ясно, что invivo фермент состоит из четырех субъединиц. Однако сукцинатдегидрогеназной активностью обладают обе формы, поэтому используемые биохимические критерии важны для заключения, была ли солюбилизирована правильная форма.

Еще одна проблема связана с тем, что в бислое мембранные белки могут образовывать комплексы из-за высокой их локальной концентрации. При солюбилизации же независимо от используемого детергента может произойти разбавление мембранных белков и их разъединение. По закону действующих масс это приведет к диссоциации комплексов, в которых взаимодействие между компонентами не очень сильное. Часто бывает трудно определить, какой комплекс образуется insitu, а какой - прн солюбилизации и очистке. Подобные проблемы возникают при исследовании многих сложных систем, например системы /3-адренергетический рецептор-адеиилатци-клаза, цепи электронного транспорта у митохондрий, системы мик-Росомных цитохромов Р450 и b$.

Для изучения стехиометрии субъединиц и их ассоциации в очищенном комплексе используется всего несколько методов: 1) химичес кое сшивание; 2) количественный анализ N-концевых аминокислот; 3) определение отношения массы субъединиц в ДСН-полиакриламидных гелях путем определения интенсивности окрашивания, с помощью радиоавтографии или иммуноблоттинга. Каждый метод имеет свои ограничения, но все они использовались на практике. Например, стехиометрию пяти субъединиц никотинового ацетил-холииового рецептора определяли с помощью количественного анализа N-коицевых аминокислот, а трех субъедиииц Fo-компоиента Н + -АТРазы Е. coli- с помощью разделения в ДСН-полиакриламидных гелях. Заметим, что кумасси бриллиантовый синий, обычно используемый для окрашивания белков после разделения в ПААГ-ДСН, связывается предпочтительнее с белками, содержащими основные аминокислотные остатки, и существуют примеры сильно неполярных внутренних мембранных белков, которые лишь едва окрашиваются.

Химическое сшивание применялось для определения ближних взаимодействий как в очищенных белковых комплексах, так и в комплексах insitu. Для анализа ближних взаимодействий в мембранных белках используется несколько специфических гидрофобных сшивающих агентов. Некоторые из них представлены в табл. 3.4. Применяемые методы не отличаются от таковых для растворимых систем. Продукты сшивания обычно анализируют с помощью электрофореза в ПААГ, часто с использованием расщепляемых сшивающих агентов, что позволяет анализировать полипептиды. Применяют также антитела к индивидуальным полипептидам для иммуноблоттинга после электрофореза в ПААГ-ДСН, чтобы идентифицировать компоненты каждого из образовавшихся продуктов. Можно было бы предположить, что при относительно большом времени жизни реагентов белки в биомембранах будут сшиваться в результате простой диффузии в бислое. Однако, по данным нескольких работ, это не так: продукты сшивания представляют собой специфические белковые ассоциаты, а не случайные образования. Так, в фотосинтетической мембране Rhodobactercapsulataобразуются сшивки лишь между субъединицами компонентов реакционного центра, а также между реакционным центром и «антенным» комплексом В870, участвующим в передаче энергии реакционному центру.

И наконец, отметим, что химическое сшивание часто использовалось для идентификации интегральных мембранных белков, которые связываются с известными растворимыми компонентами. В качестве примера можно привести сшивание 1) а- и b-субъединиц Fo-kom-понента Н + -АТРазы с /3-субъединицей растворимого компонента Fi; 2) цитохрома с с субъединицами митохондриальной цитохром с-оксидазы; 3) пептидных гормонов с рецепторами гормонов.




Таблица 4. Некоторые сшивающие реагенты, использовавшиеся для определения четвертичной структуры мембранных белков "

Липидам в составе мембран отводят, в первую очередь, структурные свойства - они создают бислой, или матрикс, в котором размещаются активные компоненты мембраны - белки. Именно белки придают разнообразным мембранам уникальность и обеспечивают специфические свойства. Многочисленные мембранные белки выполняют следующие основные функции: обусловливают перенос веществ через мембраны (транспортные функции), осуществляют катализ, обеспечивают процессы фото- и окислительного фосфорилирования, репликацию ДНК, трансляцию и модификацию белков, рецепцию сигналов и передачу нервного импульса и др.

Принято делить мембранные белки на 2 группы: интегральные (внутренние) и периферические (наружные). Критерием такого разделения служит степень прочности связывания белка с мембраной и, соответственно, степень жесткости обработки, необходимой для извлечения белка из мембраны. Так, периферические белки могут высвобождаться в раствор уже при промывке мембран буферными смесями с низкой ионной силой, низкими значениями рН в присутствии хелатирующих веществ, например этилендиаминотетраацетата (ЭДТА), связывающих двухвалентные катионы. Периферические белки выделяются из мембран при таких мягких условиях, поскольку связаны с головками липидов или с другими белками мембраны при помощи слабых электростатических взаимодействий, либо с помощью гидро-фобных взаимодействий - с хвостами липидов. Наоборот, интегральные белки представляют собой амфифильные молекулы, имеют на своей поверхности большие гидрофобные участки и располагаются внутри мембраны, поэтому для их извлечения требуется разрушить бислой. Для этих целей наиболее часто используют детергенты или органические растворители. Способы прикрепления белков к мембране довольно разнообразны (рис. 4.8).

Транспортные белки . Липидный бислой является непроницаемым барьером для большинства водорастворимых молекул и ионов, и их перенос через биомембраны зависит от деятельности транспортных белков. Можно выделить два основных типа этих белков: каналы (поры) и переносчики . Каналы представляют собой туннели, пересекающие мембрану, в которых места связывания транспортируемых веществ доступны на обеих поверхностях мембраны одновременно. Каналы в процессе транспорта веществ не претерпевают каких-либо конформационных изменений, их конформация меняется лишь при открывании и закрывании. Переносчики, наоборот, в процессе переноса веществ через мембрану изменяют свою конформацию. Причем в каждый конкретный момент времени место связывания переносимого вещества в переносчике доступно только на одной поверхности мембраны.

Каналы, в свою очередь, можно разделить на две основные группы: потенциалзависимые и регулируемые химически. Примером потенциалзависимого канала является Na + -канал, его работа регулируется изменением напряжения электрического поля. Иными словами, эти каналы открываются и закрываются в ответ на изменение трансмембранного потенциала . Химически регулируемые каналы

открываются и закрываются в ответ на связывание специфических химических агентов. Например, никотиновый ацетилхолиновый рецептор при связывании с ним нейромедиатора переходит в открытую конформацию и пропускает одновалентные катионы (подрадел 4.7 данной главы). Термины «пора» и «канал» обычно взаимозаменяемы, но под порой чаще понимают неселективные структуры, различающие вещества главным образом по размеру и пропускающие все достаточно малые молекулы. Под каналами чаще понимают ионные каналы. Скорость транспорта через открытый канал достигает 10 6 - 10 8 ионов в секунду.

Переносчики также можно разделить на 2 группы: пассивные и активные. С помощью пассивных переносчиков через мембрану осуществляется транспорт одного типа веществ. Пассивные переносчики задействованы в облегченной диффузии и лишь увеличивают поток вещества, осуществляемый по электрохимическому градиенту (например, перенос глюкозы через мембраны эритроцитов). Активные переносчики транспортируют вещества через мембрану с затратами энергии. Эти транспортные белки накапливают вещества на одной из сторон мембраны, перенося их против электрохимического градиента. Скорость транспорта с помощью переносчиков в очень сильной степени зависит от их типа и колеблется от 30 до 10 5 с -1 . Часто для обозначения отдельных переносчиков используют термины «пермеаза», «транслоказа», которые можно считать синонимами термина «переносчик».

Ферментные функции мембранных белков . В клеточных мембранах функционирует большое количество разнообразных ферментов. Одни из них локализуются в мембране, находя там подходящую среду для превращения гидрофобных соединений, другие благодаря участию мембран располагаются в них в строгой очередности, катализируя последовательные стадии жизненно важных процессов, третьи нуждаются в содействии липидов для стабилизации своей конформации и поддержания активности. В биомембранах обнаружены ферменты - представители всех известных классов. Они могут пронизывать мембрану насквозь, присутствовать в ней в растворенной форме или, являясь периферическими белками, связываться с мембранными поверхностями в ответ на какой-либо сигнал. Можно выделить следующие характерные типы мембранных ферментов:

1) трансмембранные ферменты, катализирующие сопряженные реакции на противоположных сторонах мембраны. Эти ферменты имеют, как правило, несколько активных центров, размещающихся на противоположных сторонах мембраны. Типичными представителями таких ферментов являются компоненты дыхательной цепи или фотосинтетические редокс-центры, катализирующие окислительно-восстановительные процессы, связанные с транспортом электронов и созданием ионных градиентов на мембране;

2) трансмембранные ферменты, участвующие в транспорте веществ. Транспортные белки, сопрягающие перенос вещества с гидролизом АТР, например, обладают каталитической функцией;

3) ферменты, катализирующие превращение связанных с мембраной субстратов. Эти ферменты участвуют в метаболизме мембранных компонентов: фосфолипидов, гликолипидов, стероидов и др.

4) ферменты, участвующие в превращениях водорастворимых субстратов. С помощью мембран, чаще всего в прикрепленном к ним состоянии, ферменты могут концентрироваться в тех областях мембран, где содержание их субстратов наибольшее. Например, ферменты, гидролизующие белки и крахмал, прикрепляются к мембранам микроворсинок кишечника, что способствует увеличению скорости расщепления этих субстратов.

Белки цитоскелета . Цитоскелет представляет собой сложную сеть белковых волокон разного типа и присутствует только в эукариотических клетках. Цитоскелет обеспечивает механическую опору для плазматической мембраны, может определять форму клетки, а также местоположение органелл и их перемещение при митозе. С участием цитоскелета осуществляются также такие важные для клетки процессы, как эндо- и экзоцитоз, фагоцитоз, амебоидное движение. Таким образом, цитоскелет является динамическим каркасом клетки и определяет ее механику.

Цитоскелет формируется из волокон трех типов:

1) микрофиламенты (диаметр ~ 6 нм). Представляют собой нитевидные органеллы - полимеры глобулярного белка актина и других связанных с ним белков;

2) промежуточные филаменты (диаметр 8- 10 нм). Сформированы кератинами и родственными им белками;

3) микротрубочки (диаметр ~ 23 нм) - длинные трубчатые структуры.

Состоят из глобулярного белка тубулина, субъединицы которого формируют полый цилиндр. Длина микротрубочек может достигать нескольких микрометров в цитоплазме клеток и нескольких миллиметров в аксонах нервов.

Перечисленные структуры цитоскелета пронизывают клетку в разных направлениях и тесно связываются с мембраной, прикрепляясь к ней в некоторых точках. Эти участки мембраны играют важную роль в межклеточных контактах, с их помощью клетки могут прикрепляться к субстрату. Они же играют важную роль в трансмембранном распределении липидов и белков в мембранах.