روش هیبریداسیون فلورسنت در محل (FISH) در تشخیص بیماری های کروموزومی. هیبریداسیون فلورسانس هیبریداسیون فلورسانس

• هیبریداسیون درجا فلورسانس یا روش FISH (هیبریداسیون فلورسانس در محل - FISH)، یک روش سیتوژنتیکی است که برای شناسایی و تعیین موقعیت یک توالی DNA خاص بر روی کروموزوم های متافاز یا در هسته های بین فازی در محل استفاده می شود. علاوه بر این، FISH برای شناسایی mRNA های خاص در یک نمونه بافت استفاده می شود. در مورد دوم، روش FISH امکان ایجاد ویژگی های فضایی-زمانی بیان ژن در سلول ها و بافت ها را فراهم می کند.

  روش FISH در تشخیص های ژنتیکی قبل از لانه گزینی، پیش از تولد و پس از تولد، در تشخیص بیماری های انکولوژیک و در دزیمتری بیولوژیکی گذشته نگر استفاده می شود.

مفاهیم مرتبط

میکرونوکلئوس - در سیتولوژی، قطعه ای از هسته در یک سلول یوکاریوتی که حاوی ژنوم کامل لازم برای بقای آن نیست. این یک ساختار پاتولوژیک است و در سلول های هر بافتی قابل مشاهده است. به طور معمول، ریز هسته ها در نتیجه تقسیم سلولی غیر طبیعی یا تکه تکه شدن هسته در طول آپوپتوز تشکیل می شوند.

نوترکیبی همولوگ یا نوترکیبی عمومی نوعی نوترکیبی ژنتیکی است که طی آن توالی های نوکلئوتیدی بین دو کروموزوم مشابه یا یکسان مبادله می شود. این پرکاربردترین روش سلولی برای ترمیم آسیب DNA دو رشته ای یا تک رشته ای است. نوترکیبی همولوگ همچنین باعث ایجاد انواع ترکیبات ژنی در طول میوز می شود که سطح بالایی از تنوع ارثی را فراهم می کند که به نوبه خود به جمعیت اجازه می دهد تا بهتر سازگار شوند.

Cosmids (Cosmides) - پلاسمیدهای حاوی قطعه DNA از فاژ لامبدا از جمله سایت cos. همراه با سیستم های بسته بندی در ذرات فاژ در شرایط آزمایشگاهی، آنها به عنوان مولکول های ناقل برای شبیه سازی ژن و در ساخت کتابخانه های ژنومی استفاده می شوند. کازمیدها برای اولین بار توسط کالینز و برونینگ در سال 1978 ساخته شدند. نام آنها از مخفف دو اصطلاح گرفته شده است: cos-section (خود این اصطلاح به نوبه خود از انتهای منسجم انگلیسی - انتهای چسبنده می آید) و پلاسمید.

با توجه به انباشت حجم عظیمی از اطلاعات در مورد توالی ژن ها، در حال حاضر، اغلب از روش های ژنتیک معکوس برای شناسایی عملکرد ژن ها استفاده می شود. محققان توالی ژن ها را دستکاری می کنند، یک ژن خاص را تغییر می دهند یا خاموش می کنند و تجزیه و تحلیل می کنند که این منجر به چه تغییراتی می شود. این مسیر ژنتیک معکوس است: از ژن به صفت/فنوتیپ. ژنتیک رو به جلو و معکوس رویکردهای انحصاری متقابل نیستند، بلکه مکمل یکدیگر در مطالعه عملکرد ژن هستند.
(eng. transformation) - فرآیند جذب توسط یک سلول باکتریایی یک مولکول DNA از محیط خارجی. برای اینکه یک سلول بتواند تبدیل شود، باید توانمند باشد، یعنی مولکول های DNA باید بتوانند از طریق غشای سلولی به درون آن نفوذ کنند. تبدیل به طور فعال در زیست شناسی مولکولی و مهندسی ژنتیک استفاده می شود.

اتصال انتهایی غیر همولوگ یا اتصال انتهایی غیر همولوگ (NHEJ) یکی از راه‌های ترمیم شکستگی‌های دو رشته‌ای در DNA است. این فرآیند غیر همولوگ نامیده می‌شود، زیرا بر خلاف فرآیند نوترکیبی همولوگ، انتهای آسیب‌دیده زنجیره توسط لیگاز مستقیماً و بدون نیاز به الگوی همولوگ به هم متصل می‌شوند. اصطلاح «اتصال انتهایی غیر همسان» در سال 1996 توسط مور و هابر پیشنهاد شد. NHEJ نسبت به نوترکیبی همولوگ دقت قابل توجهی کمتری دارد...

کولین ها خانواده ای از پروتئین های آبگریز هستند که به عنوان داربست برای لیگازهای یوبیکوئیتین (E3) عمل می کنند. به نظر می رسد که همه یوکاریوت ها دارای کولین هستند. آنها، در ترکیب با پروتئین های RING، لیگازهای یوبیکوئیتین کولین-RING (CRL) را تشکیل می دهند که بسیار متنوع هستند و در بسیاری از فرآیندهای سلولی نقش دارند، به عنوان مثال، پروتئولیز (حدود 20٪ پروتئین های سلولی را از بین می برند)، تنظیم اپی ژنتیک، و ایمنی گیاه با واسطه اسید سالیسیلیک. .

توالی یابی نسل بعدی (NGS) تکنیکی برای تعیین توالی نوکلئوتیدی DNA و RNA برای به دست آوردن یک توصیف رسمی از ساختار اولیه آن است. فن آوری روش های توالی یابی نسل بعدی (NGS) به شما امکان می دهد چندین بخش از ژنوم را به طور همزمان "خوانده" کنید، که تفاوت اصلی با روش های توالی یابی قبلی است. SNP با استفاده از چرخه های مکرر طویل شدن زنجیره ناشی از پلیمراز یا چند ...

کوانتیفرون (گاهی اوقات کوانتیفرون، تست کوانتیفرون؛ انگلیسی QuantiFERON) نام تجاری یک تست تشخیصی آنزیمی برای عفونت سل است که توسط شرکت آمریکایی QIAGEN ساخته شده است. این متن از فناوری ELISA برای تشخیص گامای اینترفرون پاسخ ایمنی استفاده می کند.

روش هیبریداسیون در موقعیت* (در محل، lat.) بر اساس توانایی DNA یا RNA برای تشکیل مولکول های هیبریدی پایدار با پروب های DNA / RNA به طور مستقیم بر روی آماده سازی کروموزوم های ثابت و هسته های بین فازی است. با استفاده از این روش، می توانید مکان دقیق تقریباً هر توالی DNA یا RNA را مستقیماً در سلول، هسته سلول یا کروموزوم تعیین کنید.

برای هیبریداسیون در موقعیتآماده سازی سیتولوژیک یا بافت شناسی مناسب سلول های هر بافت یا اندام، تهیه شده بر اساس روش های استاندارد. در یک آزمایشگاه سیتوژنتیک بالینی، آماده سازی لنفوسیت های خون محیطی کشت شده، سلول های سیتوتروفوبلاست اپیتلیال کوریونی، سلول های کشت شده و کشت نشده مایع آمنیوتیک، بافت های مختلف از مواد سقط جنین، و همچنین اسمیر اپیتلیوم باکال و سلول های خونی استفاده می شود.

روش هیبریداسیون در موقعیت به دلیل توسعه یک نوع غیر ایزوتوپی بر اساس استفاده از پروب های نشاندار شده با نوکلئوتیدهای اصلاح شده غیر رادیواکتیو، اهمیت ویژه ای برای سیتوژنتیک عملی دارد. انواع غیر ایزوتوپی هیبریداسیون روی آماده سازی ها (به ویژه انواع فلورسنت) در مقایسه با انواع ایزوتوپی دارای مزایای متعددی هستند: وضوح بالا، که برابر با وضوح یک میکروسکوپ است (0.1 - 0.2 میکرومتر)، بدون نیاز به پردازش آماری نتایج، سرعت و ایمنی برای محققان سلامت

علاوه بر این، ترکیب پروب‌های اصلاح‌شده متفاوت که با استفاده از سیستم‌های تشخیص مختلف شناسایی می‌شوند، امکان تعیین همزمان محل دو یا چند توالی DNA در یک سلول یا روی یک صفحه متافاز را فراهم می‌کند. و استفاده از توالی‌های تکراری که با فلوروکروم‌ها به‌عنوان پروب‌های DNA نشان‌گذاری شده‌اند، زمان عمل را به 7 تا 9 ساعت کاهش می‌دهد (هیبریداسیون کلاسیک غیر ایزوتوپی دو روز طول می‌کشد، انواع ایزوتوپی از یک هفته تا یک ماه طول می‌کشد)، که برای تشخیص قبل از تولد بسیار مهم است. استفاده روش FISHدر تشخیص سیتوژنتیک، امکان شناسایی بازآرایی‌های کروموزومی ساختاری، تعیین ماهیت کروموزوم‌های نشانگر و تجزیه و تحلیل اختلالات عددی مجموعه کروموزوم‌ها، هم در کروموزوم‌های متافاز و هم در هسته‌های بین فازی را فراهم می‌کند.

اصل روش FISH

در هسته روش FISHواکنش هیبریداسیون بین یک پروب DNA به طور مصنوعی ایجاد شده و توالی نوکلئوتیدی مکمل آن از DNA هسته ای نهفته است. مولکول DNA از دو زنجیره نوکلئوتیدی متصل به مارپیچ تشکیل شده است و هیبریداسیون تنها در صورت جدا شدن زنجیره ها امکان پذیر است. برای جدا کردن زنجیره‌های نوکلئوتیدی DNA، از دناتوره‌سازی استفاده می‌شود (برای هیبریداسیون بعدی، هم DNA موجود در هسته‌های نمونه مورد مطالعه و هم خود پروب DNA باید دناتوره شوند). پس از دناتوره شدن، پروب DNA با توالی نوکلئوتیدی مکمل خود هیبرید می شود و با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت قابل تشخیص است.

بنابراین، فرم کلی پروتکل برای تنظیم ماهیرا می توان به شکل زیر ارائه کرد:

1. تهیه یک آماده سازی بافت شناسی یا سیتولوژیک.
تهیه یک آماده سازی بافت شناسی طبق طرح استاندارد انجام می شود: برش، علامت گذاری، سیم کشی، ریختن، میکروتومی، قرار دادن برش روی یک اسلاید شیشه ای و پارافین زدایی. هنگام تهیه یک آماده سازی سیتولوژیکی، از محلول های رسوب دهنده و سانتریفیوژ ویژه استفاده می شود که امکان به دست آوردن سوسپانسیون سلولی غلیظ را فراهم می کند.

2. قبل از درمان (در صورت لزوم).
این آماده سازی توسط پروتئازها برای از بین بردن حضور پروتئین هایی که مانع هیبریداسیون می شوند، پردازش می شود.

3. استفاده از پروب DNA برای آماده سازی و دناتوراسیون بعدی.
به منظور دناتوره کردن پروب و نمونه DNA، آنها را با فرمامید درمان کرده و تا دمای حدود 90-85 درجه سانتیگراد گرم می کنند.

4. هیبریداسیون.
پس از دناتوراسیون، دارو تا دمای معینی (در مورد مطالعات بالینی 37 درجه سانتیگراد) خنک می شود و در یک محفظه مرطوب به مدت چند ساعت انکوبه می شود (مدت انکوباسیون در هر پروتکل خاص مشخص شده است). در حال حاضر از هیبریدایزرهای اتوماتیک برای دناتوره سازی و هیبریداسیون استفاده می شود.

5. شستشو.
هنگامی که هیبریداسیون کامل شد، کاوشگرهای غیر متصل باید شسته شوند، که در غیر این صورت زمینه ای ایجاد می کند که ارزیابی نتایج FISH را دشوار می کند. برای فلاشینگ معمولاً از محلولی حاوی سیترات و کلرید سدیم (SSC) استفاده می شود.

6. ضد لک.
با کمک رنگ های فلورسنت (DAPI - 4،6-diamidin-2-phenylindole؛ propidium iodide)، تمام DNA هسته ای رنگ آمیزی می شود.

7. تجزیه و تحلیل نتایج با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت. عملیات معمول (واکس زدایی، پیش تصفیه، شستشو) را می توان خودکار کرد.

* - مطالب بر اساس اطلاعات منابع باز تهیه شده است.

هیبریداسیون درجا اسیدهای نوکلئیک این روش مبتنی بر امکان تشکیل هیبریدهای دو رشته ای بین کاوشگرهای نشاندار شده است که به طور مصنوعی بر اساس توالی های تک رشته ای (ریبو- یا دئوکسی ریبو-، الیگو- یا پلی نوکلئوتید) و توالی های مکمل آنها در اهداف - مولکول های DNA یا RNA تجزیه و تحلیل شده است. برای شناسایی مکان‌های هیبریداسیون، یک کاوشگر DNA (کاوشگر DNA) با یک گروه گزارشگر برچسب‌گذاری می‌شود: ü ایزوتوپ رادیواکتیو، فلوروکروم، آنزیمی که یک لکه یا محصول درخشان می‌دهد، ü هاپتنی که بدن نشان‌دار شده با آن متصل می‌شود. و غیره.

با شناسایی یک هیبرید به دلیل وجود یک گروه گزارشگر در کاوشگر، می توان - تخمین تعداد ژن های کدکننده نوع خاصی از RNA، - تعیین نسبت DNA رونویسی نشده در ژنوم، - ایجاد کرد. پیوند ژن های خاص با یکدیگر - و مکان دقیق آنها در کروموزوم ها. روش هیبریداسیون مولکولی حساسیت بالایی دارد (مقدار کمی از پروب نشاندار شده (10-15 و 10-19 M) و بر این اساس، توالی مکمل آن در هدف قابل تشخیص است) و سرعت تجزیه و تحلیل، که امکان استفاده از این روش را هم برای تحقیق فراهم می کند. فعالیت ها و برای تشخیص بیماری های ارثی و عفونی در پزشکی، دامپزشکی و تولید محصولات زراعی.

ظهور فن‌آوری‌های جدید سیتوژنتیک مولکولی، که عمدتاً مبتنی بر هیبریداسیون درجا اسیدهای نوکلئیک است، به طور قابل‌توجهی امکانات تشخیص کروموزومی را گسترش داده است.

سیتوژنتیک اینترفاز: 1. باند کروموزومی چند رنگ (MCB). 2. هیبریداسیون درجا فلورسنت (FISH). 3. ترکیب FISH با روش های دیگر: سیتولوژی + FISH. -بافت شناسی + FISH. -ایمونوفنوتایپینگ + FISH (FICTION); سیتوژنتیک متافاز: 1. رنگ آمیزی جامد کروموزوم ها (تمام نقاشی). 2. هیبریداسیون مقایسه ای ژنومی (CGH). 3. کاریوتایپ تغییر رنگ (CCK). 4. کاریوتایپ چند رنگ: کاریوتایپ طیفی (SKY); ماهی چند رنگ (M - FISH، M - BAND).

FISH - fluorescence in situ hybridization - یک روش سیتوژنتیکی است که برای تشخیص و محلی سازی توالی های DNA خاص روی کروموزوم ها، mRNA و غیره استفاده می شود. این تکنیک بر اساس هیبریداسیون یک پروب DNA/RNA نشاندار شده با فلورسنت با یک توالی DNA/RNA مکمل است. برچسب با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت تشخیص داده می شود. روش FISH بیش از 30 سال پیش معرفی شد. این روش به عنوان روشی برای نقشه برداری فیزیکی ژن ها روی کروموزوم ها رایج شده است. بعداً در سایر زمینه های تحقیقاتی (در زمینه های ژنتیک بالینی، پزشکی تولید مثل، سم شناسی، زیست شناسی تکاملی، ژنومیک مقایسه ای و سلولی، و زیست شناسی کروموزومی) به کار گرفته شد. در حال حاضر، FISH عمدتاً برای ساختن نقشه‌های فیزیکی و ژنتیکی کروموزوم‌ها، تشخیص بازآرایی‌های ساختاری، جابه‌جایی‌ها، ریزحذف‌ها، تقویت ژن در کروموزوم‌های بین فازی و متافازی استفاده می‌شود. در نتیجه پیشرفت علم (درک بهتر از خواص شیمیایی و فیزیکی اسیدهای نوکلئیک و کروماتین)، و همچنین توسعه میکروسکوپ فلورسانس و تصویربرداری دیجیتال، این روش به طور مداوم بهبود یافته است (بهبود حساسیت، ویژگی، وضوح) و انواع مختلفی از این روش ایجاد شده است.

1) سلول ها روی یک اسلاید شیشه ای ریخته می شوند که باعث پخش شدن کروموزوم ها می شود. 4) کروموزوم ها با استفاده از DAPI رنگ آمیزی متقابل می شوند. 2) پروب دارای برچسب فلورسنت روی کروموزوم ها قرار می گیرد و مهر و موم می شود. 3) پروب و کروموزوم ها دناتوره می شوند، هیبرید می شوند و سپس شسته می شوند. 5) اسلاید زیر میکروسکوپ فلورسنت مشاهده می شود.

شکل کلی پروتکل برای راه اندازی FISH را می توان به شرح زیر نشان داد: 1. تهیه یک آماده سازی بافت شناسی یا سیتولوژیک. تهیه یک آماده سازی بافت شناسی طبق طرح استاندارد انجام می شود: برش، علامت گذاری، سیم کشی، ریختن، میکروتومی، قرار دادن برش روی یک اسلاید شیشه ای و پارافین زدایی. هنگام تهیه یک آماده سازی سیتولوژیکی، از محلول های رسوب دهنده و سانتریفیوژ ویژه استفاده می شود که امکان به دست آوردن سوسپانسیون سلولی غلیظ را فراهم می کند. 2. قبل از درمان (در صورت لزوم). این آماده سازی توسط پروتئازها برای از بین بردن حضور پروتئین هایی که مانع هیبریداسیون می شوند، پردازش می شود. 3. استفاده از پروب DNA برای آماده سازی و دناتوراسیون بعدی. به منظور دناتوره کردن پروب و DNA نمونه، آنها را با فرمامید درمان کرده و تا دمای حدود 900-85 درجه سانتیگراد گرم می کنند.

4. هیبریداسیون. پس از دناتوره شدن، دارو تا دمای معینی (در مورد مطالعات بالینی 370 درجه سانتیگراد) خنک می شود و در یک محفظه مرطوب به مدت چند ساعت انکوبه می شود (مدت زمان انکوباسیون در هر پروتکل خاص مشخص شده است). در حال حاضر از هیبریدایزرهای اتوماتیک برای دناتوره سازی و هیبریداسیون استفاده می شود. 5. شستشو. هنگامی که هیبریداسیون کامل شد، کاوشگرهای غیر متصل باید شسته شوند، که در غیر این صورت زمینه ای ایجاد می کند که ارزیابی نتایج FISH را دشوار می کند. برای فلاشینگ معمولاً از محلولی حاوی سیترات و کلرید سدیم (SSC) استفاده می شود. 6. ضد لک. با کمک رنگ های فلورسنت (DAPI - 4, 6-diamidin-2 phenylindole; propidium iodide) تمام DNA هسته ای رنگ آمیزی می شود. 7. تجزیه و تحلیل نتایج با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس عملیات معمول (واکس زدایی، پیش تصفیه، شستشو) می تواند خودکار باشد.

بررسی نواحی تلومری با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت تصاویر به دست آمده در مرحله اینترفاز (هسته) و متافاز (کروموزوم های منفرد) با هم ترکیب می شوند. رنگ آبی - DAPI.

مزایای روش FISH: 1. امکان مطالعه مواد ژنتیکی در هسته های بین فازی. 2. به دست آوردن نتایج عینی بر اساس بله/خیر یک روش کمی است؛ 3. تفسیر نسبتاً ساده نتایج؛ وضوح بالا. معایب روش FISH: 1. رنگ های فلورسنت به سرعت "محو" می شوند؛ میکروسکوپ.

روش FISH بر اساس واکنش هیبریداسیون بین یک پروب DNA ایجاد شده با استفاده از فناوری های ویژه است که یک توالی نوکلئوتیدی با اندازه محدود است و یک بخش مکمل از DNA هسته ای آماده سازی سیتوژنتیک مورد مطالعه. کاوشگر DNA عنصر اصلی برای تنظیم FISH است و دارای یک "برچسب" است، یعنی حاوی نوکلئوتیدهایی است که به طور مستقیم به یک فلوروکروم یا یک هاپتن برای تجسم بیشتر توسط آنتی بادی های حامل فلوروکروم مرتبط هستند. DNA نشاندار نشده شسته شده و سپس پروب DNA هیبرید شده با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت شناسایی می شود.

برچسب گذاری DNA به دو دسته مستقیم و غیر مستقیم تقسیم می شود. برچسب زدن مستقیم عناصر گزارشگر را به DNA - فلوروکروم ها (رودامین، دی اتیل آمینوکومارین، قرمز تگزاس و غیره) وارد می کند. روش برچسب زدن غیرمستقیم - یک نمونه DNA با لیگاندهای میانی (بیوتین، دی اکسیژنین، 2، 4-دینیتروفنول) از قبل کونژوگه می شود، حضور آن در یک آماده سازی سیتولوژیک با استفاده از فلوروکروم ها تشخیص داده می شود. در این مورد، حساسیت روش به شدت افزایش می‌یابد، زیرا لیگاند ممکن است دارای چندین مکان تعامل با فلوروکروم باشد. هیبریداسیون درجا با یک پروب نشاندار شده با 32 P اولین بار در سال 1969 توصیف شد. توسعه سیستم‌های غیر رادیواکتیو برای برچسب‌گذاری و تشخیص پروب‌های DNA، روش هیبریداسیون درجا را ایمن، آسان برای انجام و پردازش نتایج کم‌تر کرده است. رنگ های فلورسنت نرم و آسان برای استفاده هستند، می توانند به طور نامحدود ذخیره شوند، وضوح بالایی دارند و اجازه می دهند چندین توالی DNA به طور همزمان بررسی شوند.

پروب ها: پروب های برچسب دار تک رشته ای/دو رشته ای DNA/RNA اولیه/ثانویه. کاوشگرها: 1) مستقیماً: با قرار دادن نوکلئوتیدهایی که فلوروکروم به آنها متصل است (PCR یا ترجمه نیک) 2) از طریق یک مولکول گزارشگر (مثلاً دیگوکسیژنین، بیوتین) که آنتی بادی های نشاندار شده با فلورسنت به آن متصل می شوند. برای تقویت سیگنال، می توانید از آنتی بادی های ثانویه، سوم و غیره که با برچسب فلورسنت برچسب گذاری شده اند استفاده کنید. DNA پلیمراز DNA Nick Translation DNA پلیمراز I نوکلئوتیدهای جدیدی را به 3' هیدروکسیل DNA پلیمراز I اضافه می کند، بازهای جداگانه را از تصویربرداری کروموزوم انتهای 5' حذف می کند: با استفاده از DAPI (2 میلی گرم در میلی لیتر). 4'، 6-diamidino-2-phenylindole; اتصال قوی به مناطق DNA غنی از A-T. تحریک با نور UV؛ انتشار 461 نانومتر (آبی).

در حال حاضر، چندین رویکرد اصلی وجود دارد که به طور گسترده توسط سیتوژنتیک مولکولی مدرن استفاده می شود: شناسایی مواد مناطق کروموزوم گسترده و کروموزوم های کامل. تشخیص در ناحیه مورد نظر یک توالی DNA خاص. تجزیه و تحلیل عدم تعادل مناطق کروموزومی فردی. برای شناسایی مواد مناطق کروموزومی گسترده و کروموزوم‌های کامل، پروب‌های DNA مخصوص کروموزوم و ناحیه خاص ("کاوشگرهای نقاشی") به طور گسترده استفاده می‌شوند.

مشخصات انواع مختلف پروب ها 1. پروب های اختصاصی مکان (LSI - مکان - شناسه های اختصاصی که به مناطق خاصی از کروموزوم ها متصل می شوند.) این پروب ها برای شناسایی توالی کوتاه (غیر تکرار شونده) DNA ایزوله شده موجود استفاده می شوند. برای تهیه یک پروب نشاندار و هیبریداسیون بعدی آن با مجموعه ای از کروموزوم ها. آنها برای تشخیص انحرافات کروموزومی مهم تشخیصی و پیش آگهی در شرایط مختلف پاتولوژیک (مونوسومی و تریزومی برای کروموزوم های فردی) طراحی شده اند. بیشترین استفاده از این نمونه ها در تشخیص سیتوژنتیک قبل از تولد، به ویژه در مطالعات سلول های بافت کوریونی و هسته های بین فاز آمنیوسیت ها به دست آمد.

2. کاوشگرهای DNA به مناطق تلومری کروموزوم ها (TEL telomericprobe) برای شناسایی حذف ها و بازآرایی های موثر بر نواحی انتهایی بازوهای کروموزوم طراحی شده اند. چنین کاوشگرهایی مخصوص بازوهای p یا q کروموزوم ها هستند و مکمل ناحیه ای به طول حدود 300 کیلوبایت هستند. از انتهای کروموزوم به عنوان یک قاعده، کاوشگرهای DNA برای بازوهای کوتاه و بلند کروموزوم ها با فلوئوروکروم های مختلف مرتبط هستند، که امکان تشخیص هر دو ناحیه تلومری کروموزوم را در یک آماده سازی سیتوژنتیکی ممکن می سازد.

3. کاوشگرهای تکراری سانترومر، شمارشگرهای آلفا یا کروموزومی (CEP - centromere. Enumeration. Probe) پروب های DNA مخصوص کروموزوم هستند که با توالی هایی از تکرارهای ماهواره ای پشت سر هم آلفا و بتا نشان داده می شوند. این تکرارها عمدتاً در نواحی هتروکروماتین سانترومر یا پری‌سانترومریک کروموزوم‌ها قرار دارند. با کمک آنها، هر کروموزوم را می توان به رنگ متفاوتی رنگ کرد، که به شما امکان می دهد به سرعت تعداد کروموزوم ها و انحرافات از تعداد طبیعی آنها را تعیین کنید، مکمل بخش های جداگانه کروموزوم، اما به طور کلی تمام طول آن را پوشش می دهد. با استفاده از کتابخانه ای از چنین کاوشگرهایی، می توان کل کروموزوم را "رنگ" کرد و کاریوتیپ طیفی تفاضلی یک فرد را به دست آورد. این نوع تجزیه و تحلیل برای تجزیه و تحلیل انحرافات کروموزومی، مانند جابه جایی، زمانی که قطعه ای از یک کروموزوم به شانه کروموزوم دیگری منتقل می شود، استفاده می شود.

برنامه های کاربردی FISH به طور گسترده ای برای حل وظایف تشخیصی بالینی زیر استفاده می شود: 1. قبل از لانه گزینی قبل از تولد و تشخیص ناهنجاری های کروموزومی. در کلینیک های لقاح آزمایشگاهی (IVF) و مراکز پری ناتال استفاده می شود. اجازه می دهد تا به موقع (قبل از کاشت جنین در مورد IVF یا در مراحل اولیه رشد جنین) اختلالات ژنتیکی در نوزاد متولد نشده شناسایی و اقدامات لازم انجام شود. 2. انکوهماتولوژی. بیماری های انکوهماتولوژیک در نتیجه ناهنجاری های کروموزومی مختلف ایجاد می شوند، بنابراین از پروب های مناسب CEP و LSI برای تشخیص آنها استفاده می شود. 3. تشخیص تومورهای جامد. در حال حاضر، بیشتر و بیشتر روابط علت و معلولی بین ایجاد سرطان های خاص و تغییرات خاص در ژنوم ایجاد می شود. بنابراین، هنگام استفاده از پروب های DNA مناسب، می توان تشخیص FISH انکولوژیک را انجام داد.

سیتوژنتیک اینترفاز: ترکیب FISH با روش های دیگر: - ایمونوفنوتایپینگ FISH (FICTION). + FICTION (فلورسانس ایمونوفنوتایپ و سیتوژنتیک رابط به عنوان ابزاری برای بررسی نئوپلاسم ها) - برای مطالعه سلول های تومور. برای این تجزیه و تحلیل، از اسمیرهای بدون رنگ خون، مغز استخوان یا آماده سازی سایر بافت ها استفاده می شود. مرحله 1 - آماده سازی با آنتی بادی های مونوکلونال خاص انکوبه می شود، مرحله 2 - کونژوگاسیون با فلوروفورها برای تجسم بعدی مجموعه آنتی بادی مونوکلونال آنتی ژن انجام می شود. مرحله 3 - هیبریداسیون درجا با پروب های DNA انجام دهید. فلوروفورهایی که از نظر رنگ متفاوت هستند برای شناسایی آنتی بادی های مونوکلونال و پروب های DNA استفاده می شوند. مطالعه آماده سازی در زیر میکروسکوپ فلورسنت با مجموعه ای از فیلترهای لازم امکان تجزیه و تحلیل همزمان ایمونوفنوتیپ هیبریداسیون و سیگنال ها را در هسته های بین فازی فراهم می کند.

حذف کروموزومال TNFAIP 3 در سال. HL توسط سیتوژنتیک اینترفاز شناسایی شد. FICTION تجزیه و تحلیل از. نماینده ج. موارد HL ترکیب شده است. بیان CD 30 (قرمز) و پروب های FISH برای TNFAIP 3 و کروموزوم 6 سانترومر (آبی [b]). در سنجش دو رنگ در A-C و E و F، پروب TNFAIP 3 به رنگ سبز (g) برچسب گذاری شده است. در سنجش سه رنگ اعمال شده در D، پروب TNFAIP 3 یک سیگنال colocalized (co) گرم به رنگ نارنجی می دهد. دو استراتژی مختلف برای نمایش سنجش های FISH دو و سه رنگ در ترکیب با ایمونوفلورسانس CD 30 استفاده می شود. من. ه. ، سنجش های دو رنگ (A-C و E و F) با استفاده از یک نمایشگر سه رنگ نشان داده می شوند، در حالی که یک نمایشگر چند رنگ کاذب که توسط نرم افزار Isis به دست آمده است برای سنجش سه رنگ (D) استفاده می شود تا به طور همزمان چهار رنگ را نشان دهد. به عنوان مثال، CD 30 [r]، TNFAIP 3 [g] و نارنجی، و کروموزوم 6 سانترومر [b]).

ضبط دیجیتالی ریز تصاویر امکان تبدیل به شبه رنگ‌ها را نه تنها ترکیبی از فلوروفورها، بلکه نسبت‌ها و شدت‌های آنها را نیز باز کرده است.

رنگ آمیزی چند رنگ کروموزوم ها (Muli. Color Banding - MSV) این روش برای تجزیه و تحلیل کامل همه کروموزوم ها نیست، بلکه برای تجزیه و تحلیل دقیق یک کروموزوم منفرد در نظر گرفته شده است. کاوشگرهای DNA اختصاصی لوکوس با فلوروفورها یا ترکیبی از فلوروفورهای مختلف برچسب‌گذاری می‌شوند تا سطح سیگنال هر یک از پروب‌های DNA از نظر شدت متفاوت باشد. پروفیل‌های شدت همپوشانی سیگنال‌های پروب DNA، تغییراتی را در نسبت‌های شدت فلورسانس فلوروفورهای مختلف در طول کروموزوم ایجاد می‌کنند. نسبت های شدت را می توان به شبه رنگ ها ترجمه کرد و بنابراین هر نقطه از تصویر، و در نتیجه، هر یک از مکان های کروموزومی، شبه رنگ خود را خواهد داشت. این نوع روش FISH چند رنگ در تجزیه و تحلیل نه تنها بازآرایی‌های بین کروموزومی بلکه درون کروموزومی در بیماری‌های انکولوژیک بسیار مؤثر است. اما برای کاربرد موفقیت آمیز آن، ابتدا باید کروموزوم مورد بررسی را مشخص کرد. این روش سیتوژنتیک مولکولی برای تجزیه و تحلیل اختلالات کاریوتیپ مرتبط با کروموزوم های خاص مناسب است.

تا به امروز، مجموعه‌ای از پروب‌های DNA ایجاد شده‌اند که MCV را برای همه کروموزوم‌های انسان در کروموزوم 5 فراهم می‌کنند؛ نواربندی چند رنگ کروموزوم 5؛ ایدیوگرام کروموزوم 5؛ فلوئوروکروم‌های مورد استفاده برای MSV).

سیتوژنتیک متافاز که از نظر تاریخی زودتر از سیتوژنتیک اینترفاز بوجود آمده است، تعیین طیف وسیعی از اختلالات کروموزومی را ممکن می سازد، اما برای این امر لازم است سلول های مورد مطالعه در مرحله متافاز میوز قرار گیرند.

کاریوتایپینگ چند رنگ تجزیه و تحلیل با استفاده از پروب های DNA رنگ آمیزی مداوم به بازوها یا کروموزوم های کامل (کاوشگرهای WCP - رنگ کل کروموزوم) انجام می شود. چنین پروب هایی با توالی های DNA کوتاه متعددی که در طول کل کروموزوم قرار دارند هیبرید می شوند. بنابراین، هنگامی که در زیر میکروسکوپ فلورسنت مشاهده می شود، کروموزوم به طور یکنواخت در یک رنگ خاص به نظر می رسد.

پروب‌های DNA مورد استفاده برای این تجزیه و تحلیل شامل مخلوطی از پروب‌های رنگ‌آمیزی جامد برای مجموعه کامل کروموزوم‌های انسانی است که با ترکیبی از چندین فلوروکروم برچسب‌گذاری شده‌اند که نسبت آن‌ها به‌صورت جداگانه برای هر جفت کروموزوم انتخاب می‌شود. استفاده از روش‌های ثبت مناسب و برنامه‌های کامپیوتری برای تجزیه و تحلیل تصویر، که شدت درخشندگی تمام فلوروکروم‌ها را برای هر نقطه از تصویر ارزیابی می‌کند، امکان انجام کاریوتایپینگ را فراهم می‌کند که در آن هر جفت کروموزوم دارای "شبه رنگ" منحصر به فرد خود است. ".

M-FISH (Multitarget Multicolor Multicolor یا Multiplex. FISH) نام عمومی FISH چند رنگ سنتی با استفاده از مجموعه فیلترهای خاص فلوروکروم است. اصل M-FISH شامل ضبط دیجیتال جداگانه سیگنال تمام فلورکروم های استفاده شده است که با تغییر متوالی مجموعه فیلترها به دست می آید. همه تصاویر در فایل‌های جداگانه ضبط می‌شوند، که این امکان انجام پردازش کارآمد آنها را در ارتباط با جداسازی سیگنال و پس‌زمینه و همچنین تعیین کمیت سیگنال فراهم می‌کند. پردازش تمام اطلاعات ثبت شده با کمک نرم افزار ویژه، اطلاعات مربوط به سطح سیگنال های فلوئوروکروم در هر نقطه از تصویر را به شبه رنگ تبدیل می کند. یکی از محدودیت‌های اصلی تعداد پروب‌های DNA مورد استفاده، تعداد فلوئوروکروم‌های موجود، با طیف‌های تحریک و انتشار غیرهمپوشانی، و در دسترس بودن مجموعه‌های فیلتر مناسب است.

ماهی 24 رنگ پرمصرف ترین M-FISH ماهی 24 رنگ برای شناسایی همزمان مواد از همه کروموزوم های انسان است. در تشخیص جابجایی های کروموزومی بسیار کارآمد است، اما برای تشخیص حذف ها و وارونگی ها طراحی نشده است. با این حال، این مشکل را می توان تا حدی با رنگ آمیزی همزمان کروموزوم ها با DAPI حل کرد، که امکان تجزیه و تحلیل striation دیفرانسیل کروموزوم هایی را که مواد کروموزوم آنها قبلاً شناسایی شده است را ممکن می سازد. متأسفانه، باید توجه داشت که کیفیت نواربندی کروموزوم DAPI پس از M-FISH به طور قابل توجهی از رنگ‌آمیزی دیفرانسیل GTG و حتی باند DAPI پس از هیبریداسیون درجا معمولی پایین‌تر است.

Rx. FISH اصل M-FISH برای تولید یک بارکد چند رنگ برای کروموزوم های انسانی و یک روش نواربندی کروموزوم چند رنگ بر اساس هیبریداسیون درجا بین گونه ها استفاده شد. برخلاف FISH 24 رنگی، این روش تشخیص مستقیم بخشی از بازآرایی های داخل کروموزومی را ممکن می سازد. کاوشگرهای DNA مورد استفاده در Rx. FISH دارای برچسب ترکیبی از 3 فلوئوروکروم است که 7 شبه رنگ را ارائه می دهد. آنها به طور خاص مناطق جداگانه کروموزوم ها را رنگ می کنند و خطوط رنگی آنها را ایجاد می کنند. این ویژگی نمونه های DNA برای Rx است. FISH بر اساس روش به دست آوردن آنها تعیین می شود. آنها کتابخانه های DNA کروموزوم خاص دو گونه گیبون هستند: Hylobates concolor و Hylobates syndactylus.

در نتیجه بازآرایی‌های کروموزومی شدیدی که در طول شکل‌گیری گونه‌های گیبون مدرن رخ داد، معلوم شد که مواد کروموزوم‌های آنها در مقایسه با سازماندهی کروموزوم‌ها در انسان‌ها که کروموزوم‌های آن به محافظه کاری معروف هستند، به شدت در هم ریخته است. نسبت کروموزوم 1 انسان به کروموزوم های گیبون در شکل 1 نشان داده شده است.

شکل 2 نمای کلی کروموزوم های انسانی به دست آمده در نتیجه Rx را نشان می دهد. ماهی. الف) صفحه متافاز ب) آرایش کروموزوم ها.

با این حال، RXFISH محدودیت‌های جدی دارد - بازآرایی‌های کروموزومی که در یک باند RX رنگی رخ داده‌اند، با استفاده از این روش قابل تشخیص نیستند، مگر اینکه منجر به تغییرات قابل توجه و به راحتی قابل مشاهده در اندازه این باند شوند. - پروب ها چندین ناحیه کروموزومی از کروموزوم های مختلف را در یک شبه رنگ رنگ می کنند. با این حال، با افزایش تعداد فلوئوروکروم های مورد استفاده، روش RXFISH بدون شک آموزنده تر از FISH معمولی 24 رنگ خواهد بود.

مزایای RXFISH در حال حاضر شامل نکات زیر است: این روش امکان تجزیه و تحلیل کل ژنوم انسان را در یک آزمایش FISH تک رنگ می دهد. مجموعه‌های تجاری موجود از پروب‌های DNA نشان‌دار و سیستم‌های تشخیص لازم در دسترس هستند. این روش امکان شناسایی سریع بخش قابل توجهی از بازآرایی های درون و بین کروموزومی را فراهم می کند. شناسایی خودکار کروموزوم های متافاز "باند رنگی" امکان پذیر است. هر کروموزوم انسانی یک بارکد رنگی منحصر به فرد دارد. RXFISH در ایستگاه کاری Cyto یکپارچه شده است. بینایی و سیستم های میکروسکوپ فلورسانس استاندارد

کاریوتایپینگ طیفی (SKY-spectralkaryotyping) اصول اولیه تجزیه و تحلیل تصویر میکروسکوپی در کاریوتایپ طیفی عملاً همان مواردی است که در M-FISH استفاده می شود. تفاوت ها مربوط به نحوه ثبت تصویر است. فناوری SKY به شما امکان می دهد منحنی های طیفی را برای تمام نقاط تصویر در طول یک اندازه گیری به دست آورید، صرف نظر از اینکه با اپی فلورسانس مرتبط است یا با میکروسکوپ نوری سنتی. برای کاریوتایپینگ طیفی همه کروموزوم‌های انسان، از پنج فلوئوروکروم استفاده می‌شود، یکی در طیف سبز، دو رنگ قرمز و دو مورد در مادون قرمز. برانگیختگی و انتشار تمام فلوئوروکروم‌های مورد استفاده در برچسب‌گذاری پروب‌های DNA با یک مجموعه از فیلترها انجام می‌شود که امکان جلوگیری از تغییر متوالی آنها، فوکوس میانی و در نتیجه مشکلات مرتبط مانند تغییر فضایی تصویر، تعیین مقادیر آستانه را ممکن می‌سازد. و ماسک های تقسیم بندی بر اساس تجزیه و تحلیل منحنی های طیفی، وجود یا عدم وجود فلوروکروم های خاص در یک نقطه مشخص تعیین می شود.

مرحله بعدی روش طبقه بندی است که به شما امکان می دهد به طور مستقیم و بدون ابهام وابستگی کروموزومی مواد مورد تجزیه و تحلیل را تعیین کنید. این امر شناسایی قابل اعتماد (تا یک کروموزوم) مواد کروموزوم نشانگر و همچنین مشتقات کروموزوم ناشی از بازآرایی های مختلف را تضمین می کند. مزیت بزرگ SKY این است که رنگ آمیزی DAPI به موازات تصویر طیفی ثبت می شود. بهبود نرم افزار باندینگ DAPI امکان دستیابی به striation دیفرانسیل در کیفیت نزدیک به باند GTG را می دهد. امکان تجزیه و تحلیل موازی تصویر طیفی و رنگ‌آمیزی دیفرانسیل کیفی کروموزوم‌ها، تفسیر نتایج SKY را بسیار ساده می‌کند و امکان تعیین دقیق‌تر نقاط شکست کروموزوم را فراهم می‌کند. از مزایای بدون شک SKY می توان به امکان استفاده از فلوئوروکروم هایی با طیف های تحریک و انتشار همپوشانی اشاره کرد که به طور قابل توجهی لیست فلوئوروکروم های قابل استفاده را گسترش می دهد و همچنین تعداد فلوروکروم هایی را که می توان به طور همزمان استفاده کرد افزایش می دهد. فهرست بندی یک فلوروکروم جدید نیازی به خرید مجموعه جدیدی از فیلترها ندارد، زیرا یک واحد فیلتر برای FISH طیفی و یک واحد فیلتر برای DAPI برای SKY کافی است.

معایب SKY عبارتند از: - زمان نوردهی طولانی، لازم برای ضبط تصاویر میکروسکوپی. - SKY در تحقیقات با کاوشگرهای نسبتا کوچک DNA کمی کمتر از M-FISH است.

کاریوتایپینگ تغییر رنگ (CCKs Color changer caryotyping) این روش بر اساس تجزیه و تحلیل تفاوت طول سیگنال بین نمونه‌های DNA هیبرید شده با پروب‌های DNA مرتبط با فلوروکروم‌ها و پروب‌های DNA حامل آنتی‌بادی است. این روش تنها با 3 فیلتر قابل اجرا است و نیازی به دوربین و نرم افزار خاصی ندارد. برای شناسایی کروموزوم ها، یک هیبریداسیون انجام می شود و دو تصویر به دست می آید. این روش بر اساس تفاوت در طول سیگنال فلورسنت است، زیرا زمان قرار گرفتن در معرض نمونه های DNA مرتبط با آنتی بادی ها 80 تا 90٪ کمتر از نمونه های مرتبط با فلوروکروم است. پس از واکنش هیبریداسیون، سواب‌ها در معرض آنتی‌بادی‌های اولیه مناسب قرار می‌گیرند و سپس برای به دست آوردن اولین تصویر، تجسم می‌شوند. سپس اسلایدها در معرض آنتی بادی های ثانویه و آویدین متصل به همان فلوروکروم قرار می گیرند. ضربه ها را می توان با استفاده از DAPI رنگ آمیزی کرد.

در آینده، دوباره تصاویری از آماده سازی ها با استفاده از 3 فیلتر به نوبه خود به دست می آید. این تصاویر با استفاده از نرم افزار مخصوص مقایسه شده و تصویر دومی به دست می آید که در آن فقط کروموزوم های مرتبط با آنتی بادی های خاص قابل مشاهده خواهند بود. بنابراین، برخی از کروموزوم ها فقط در اسکن اول یا دوم فلورسانس می شوند، در حالی که برخی دیگر در اسکن های مختلف تغییر رنگ می دهند.

هیبریداسیون مقایسه ای ژنومی (CGH) این روش برای شناسایی اختلالات کمی در ژنوم ایجاد شد. این مبتنی بر انجام یک واکنش هیبریداسیون درجا با استفاده از کل ژنوم به عنوان یک پروب DNA است. DNA دهنده جدا شده و طبیعی با فلوروکروم هایی با رنگ های مختلف برچسب گذاری می شود، بنابراین آنها را به پروب DNA تبدیل می کند. مقادیر معادل این پروب ها مخلوط شده و در هیبریداسیون با یک آماده سازی سیتوژنتیک کنترل استفاده می شود. پس از FISH، متافازها بر روی یک میکروسکوپ فلورسنت، با استفاده از یک برنامه تحلیل تصویر کامپیوتری تخصصی برای تعیین شدت فلورسانس دو فلوئوروکروم در طول کل هر کروموزوم، تجزیه و تحلیل می‌شوند.

در غیاب تغییرات کمی در کاریوتیپ نمونه آزمایشی، نسبت خاصی از شدت لومینسانس دو فلوئوروکروم مشاهده خواهد شد. در صورت تکثیر ژن، شدت سیگنال فلوئوروکروم مربوطه افزایش می یابد و در صورت از بین رفتن بخشی از ماده ژنتیکی، برعکس، ضعیف می شود. بنابراین، CGH تشخیص عدم تعادل ژنومی را ممکن می‌سازد، اما از این روش نمی‌توان برای تشخیص جابه‌جایی‌ها و وارونگی‌های متعادل استفاده کرد و تریزومی‌ها و حذف‌ها تنها در صورتی قابل تشخیص هستند که اندازه ناحیه نامتعادل حداقل 10 میلیون جفت باز باشد.

عدم تعادل کروموزومی در نمونه آزمایشی از تفاوت در شدت فلورسانس دو فلوئوروکروم مختلف با محاسبه نسبت فلورسنت (RF) تخمین زده می شود.

روش CGH نسبت به روش‌های دیگر برای تجزیه و تحلیل تغییرات ژنوم مزایای زیادی دارد: اول اینکه به منبع ماده آزمایشی بستگی ندارد و با مقدار کمی DNA آزمایش شده، از جمله مواد آرشیوی، می‌تواند با موفقیت انجام شود. ثانیاً، امکان به دست آوردن اطلاعات دقیق در مورد از دست دادن یا افزایش تعداد کپی‌های ماده ژنتیکی در سراسر ژنوم در یک آزمایش واحد را می‌دهد. ثالثاً، روش CGH نیازی به تهیه آماده سازی کروموزوم متافاز از بافت مورد مطالعه ندارد، یعنی به فرآیند کشت سلولی و مصنوعات مرتبط بستگی ندارد.

هیبریداسیون درجا ژنومی (ژنومایسین درجا هیبریداسیون در، GISH) گونه ای از روش هیبریداسیون درجا است که شامل این واقعیت است که برای هیبریداسیون با نمونه های ثابت، کل DNA ژنومی یک گونه از ارگانیسم به عنوان یک پروب نشاندار شده با فلورسنت استفاده می شود. که کل DNA ژنومی گونه دیگری از ارگانیسم با آن رقابت می کند. برای تعیین تفاوت های بین گونه ای و درون گونه ای در ژنوم ها، بازآرایی های کروموزومی، حذف ها و جایگزینی ها استفاده می شود.

تغییرات FISH 1) Q-FISH - ماهی کمی: توسعه یافته توسط Lansdorp و همکاران: U. M. Martens، J. M. Zijlmans، S. S. Poon، W. Dragowska، J. Yui، E. A. Chavez، R. K. Ward، و P. M. Lansdorp. 1998. تلومرهای کوتاه در کروموزوم انسانی 17 ص. نات. ژنت 18:76-80. روش کمی طراحی شده برای کار با فلوسیتومتری. در اصل برای اندازه گیری طول کروموزوم (رزولوشن: 200 جفت باز) با شمارش تعداد تکرارهای تلومری استفاده می شد. پروب های کونژوگه با PNA استفاده می شود. در ابتدا کروموزوم های متافاز مورد مطالعه قرار گرفتند (QFISH proper)، در حال حاضر این روش برای کروموزوم های بین فازی (IQ-FISH) نیز قابل استفاده است. Q-FISH بر روی کشت سلولی، بخش های بافتی (هر دو روی شیشه) انجام می شود. در حال حاضر Q-FISH یک ابزار مهم در مطالعه نقش تلومرها در فرآیندهای پیری و تشکیل سرطان است.

PNA-FISH - اسیدهای نوکلئیک پپتیدی FISH: اسیدهای نوکلئیک پپتیدی (PNAs) آنالوگ های مصنوعی DNA هستند که در آنها ستون فقرات قند دئوکسی ریبوز فسفات، که پایه نیتروژنی را پشتیبانی می کند، با یک ستون فقرات پپتیدی شارژ نشده جایگزین می شود. در نتیجه این ساختار: هنگامی که پروب الیگومری PNA با DNA/RNA مکمل هیبرید می شود، هیچ دافعه الکترواستاتیکی رخ نمی دهد. دوبلکس های PNA-DNA (PNA-RNA) بسیار پایدارتر از هومو/هترودپلکس های طبیعی هستند. ویژگی بالای اتصال PNA-DNA: هیبریداسیون PNA-DNA به عدم تطابق جفت باز بسیار حساس تر از هیبریداسیون DNA-DNA است. بنابراین، با استفاده از یک پروب PNA، دو تکرار سانترومریک را می توان تشخیص داد که تنها در یک جفت باز متفاوت هستند. PNA آبگریزی نسبی دارد (در مقایسه با DNA)، در نتیجه PNA بهتر از طریق دیواره های سلولی پخش می شود => کاربرد وسیع در میکروبیولوژی. بر اساس ویژگی اتصال بالا: اعتقاد بر این است که فناوری PNA به زودی مبنایی برای ایجاد پروب‌های اختصاصی آلل برای هیبریداسیون درجا خواهد شد. در ژنتیک، سیتوژنتیک، اپی ژنتیک، میکروبیولوژی و غیره استفاده می شود.

3) Flow-FISH - FISH برای فلوسیتومتری: پیشنهاد در سال 1998 توسط: Rufer, N., Dragowska, W., Thornbury, G., Roosnek, E. & Lansdorp, PM دینامیک طول تلومر در زیرجمعیت های لنفوسیتی انسانی که با جریان اندازه گیری شده اند. . زیست فناوری طبیعت 16, 743-747 (1998). ترکیبی از Q-FISH و فلوسیتومتری که امکان تجزیه و تحلیل سیگنال (اندازه گیری) و مرتب سازی را فراهم می کند. برای flow-FISH، از یک سوسپانسیون سلولی (برای اندازه گیری طول تلومرهای کروموزوم)، گسترش کروموزوم و کروموزوم های جدا شده (برای نقشه برداری بیشتر) استفاده می شود. همانند Q-FISH، از پروب های تلومری دارای برچسب PNA استفاده می شود (به عنوان مثال، برای تصویربرداری و اندازه گیری طول تکرارهای تلومری). این به طور گسترده ای برای مطالعه مشکلات مختلف استفاده می شود: پیری، حفظ تلومر، مطالعه سوسپانسیون سلول های بنیادی خونساز ex vivo، مطالعه باکتری ها.

تجزیه و تحلیل چند پارامتری امکان تمایز انواع سلول را در یک نمونه فراهم می کند و امکان کنترل داخلی و تجزیه و تحلیل زیرگروه های لکوسیت را فراهم می کند.

مزایای flow-FISH: نتایج به راحتی قابل تکرار توانایی تجزیه و تحلیل زیر گروه های سلولی در یک جمعیت با استفاده از ایمونوفلورسانس فیزیکی و نشانگرها عملکرد بهتر نسبت به Q-FISH توانایی تعیین کمیت فلورسانس هزاران سلول.

بررسی کروموزوم های ایزوله شده توسط فلوسیتومتری 1. مرتب سازی کروموزوم توسط فلوسیتومتری - کاریوتایپینگ توسط فلوسیتومتری برای نقشه برداری بیشتر ژن و ساخت کتابخانه های کروموزوم استفاده می شود. - شناسایی و محلی سازی ژن ها روی کروموزوم های مرتب شده با استفاده بعدی از روش های FISH / روش PRINS (پرایم شده در برچسب گذاری درجا) یا تغییرات آن و PCR اختصاصی کروموزوم انجام می شود. - تا سال 2011، تنها کروموزوم های 17 گونه از گیاهان کشت شده تاکنون با موفقیت مرتب شده اند. - مرتب سازی کروموزوم های متافاز یا پاکیتنیک با شاخص تقسیم بالا.

برچسب فلورسنت: - کروموزوم ها با فلوئوروکروم خاص اسید نوکلئیک نشاندار می شوند. - فلوئوروکروم ها مطابق با 1) ویژگی برای بازهای نیتروژنی، 2) شرایط آزمایشی (از جمله در نظر گرفتن طول موج لیزرهای موجود) انتخاب می شوند. 1. برای تجزیه و تحلیل تک متغیری، از رنگ هایی استفاده کنید که مخصوص بخارات AT یا GC نیستند: یدید پروپیدیوم (پیک تحریک: 535 نانومتر، انتشار: 617 نانومتر، لیزر مورد نیاز: لیزر یا لامپ آرگون 488 نانومتر + فیلتر طولانی گذر) اتیدیوم بروماید ( پیک های تحریک: 300 و 520 نانومتر، انتشار: 600 نانومتر، لیزر مورد نیاز: لیزر یا لامپ آرگون 488 نانومتر + فیلتر طولانی گذر) این برچسب ها DNA را بدون توجه به محتوای A، G، T یا بازهای نیتروژن دار رنگ می کنند. 2. برای تجزیه و تحلیل دو متغیره استفاده کنید: کرومومایسین (ویژه برای جفت بازهای G-C)، پیک تحریک A3: 458 نانومتر، انتشار 580 نانومتر. لیزر: 458 نانومتر حداقل 400 متر توان ولت. Hoechst 33258 (ویژه برای A-T bp)، تحریک: 351-364 نانومتر، انتشار: 470 نانومتر. لیزر: 351 -364 نانومتر (قدرتمند). به دلیل همپوشانی جزئی طیف های فلوروکروم، لیزرها باید در زمان و مکان از هم جدا شوند.

2. مطالعه کروموزوم ها/ توالی های نوکلئوتیدی پس از مرتب سازی (برای ساختن نقشه های فیزیکی و ژنتیکی و ...) FISH BAC-FISH PRINS C-PRINS مطالعه ژنوم های بزرگ با کروموزوم های بلند. نقشه برداری از توالی با تعداد زیادی تکرار (مثلاً مناطق تلومری و سانترومر). استفاده از پروب های کوتاه به دلیل تعداد زیاد تکرار، سیگنال قوی است. اندازه پروب استاندارد: 15 تا 30 نوکلئوتید. ماهی

مشکلات FISH: محلی‌سازی توالی‌های DNA تک جایگاهی (یعنی توالی‌های DNA منحصربه‌فرد غیر تکراری) دشوار است، زیرا سیگنال هنگام استفاده از پروب‌های کوتاه استاندارد بسیار ضعیف خواهد بود. افزایش طول پروب به چندین کیلو باز برای تقویت سیگنال منجر به کاهش حساسیت و => اتصال غیر اختصاصی می شود. راه‌حل: BAC-FISH -BAC-FISH ترکیبی از روش FISH و استفاده از کلون‌های DNA ژنومی است که در کروموزوم‌های مصنوعی باکتریایی (BACs) جاسازی شده‌اند و امکان درج توالی‌های DNA بزرگ را فراهم می‌کنند. - روشی کارآمد برای شناسایی و نقشه برداری کروموزوم های منفرد موجودات با ژنوم کوچک. پروب های BAC، overgos (الیگونوکلئوتیدهای همپوشانی) به عنوان یک پروب استفاده می شوند.

جایگزین برای FISH: PRINS PRINS (با برچسب گذاری درجا) روشی برای برچسب زدن کروموزوم ها با بازپخت یک پرایمر DNA الیگونوکلئوتیدی با یک توالی همولوگ از DNA کروموزومی دناتوره شده و متعاقب آن گسترش آنزیمی پرایمر در محل با نوکلئوتیدهای نشاندار شده است. اولین بار توسط Koch و همکاران توصیف شد. در سال 1989 (Koch, JE, Kølvraa, S., Petersen, KB, Gregersen, N., and Bolund, I. (1989) روشهای پرایمینگ الیگونوکلئوتیدی برای برچسب زدن کروموزوم خاص DNA ماهواره آلفا در محل. Chromosoma 98, 29 -265). PRINS جایگزینی برای FISH است. برای محلی سازی توالی های نوکلئوتیدی، شناسایی و شمارش کروموزوم های متافاز یا بین فاز یا جفت کروموزوم ها (از جمله آنوپلوئیدی کروموزومی) استفاده می شود. بازپخت پرایمر نشاندار نشده (پرایمر-پرایمر) با DNA مورد نظر؛ طویل شدن پرایمر با کمک DNA پلیمراز مقاوم در برابر حرارت و نوکلئوتیدهای نشاندار شده؛ خاتمه واکنش (اتصال یک مولکول مسدودکننده به انتهای 3) پرایمر: قطعه محدود کننده PCR؛ - غیرمستقیم (بیوتین/ آویدین کونژوگه با فلوروکروم دیگ/ ضد حفاری) - فقط یک جفت کروموزوم همولوگ (یک کروموزوم) در نتایج هر واکنش PRINS قابل شناسایی است. واکنش PRINS بعدی در همان اسلاید فقط پس از مسدود کردن اسلاید قبلی قابل انجام است. - برای توالی های DNA با تعداد تکرار زیاد استفاده می شود.

مزایای PRINS: 1. به حداقل اطلاعات توالی مورد نیاز برای سنتز یک پرایمر الیگونوکلئوتیدی نیاز دارد. 2. سریعترین و ساده ترین روش برای تشخیص یک توالی مورد علاقه در یک کروموزوم (در مقایسه با استفاده از پروب های سنگین FISH که در یک دوره زمانی بسیار طولانی هیبرید می شوند). 3. حذف مرحله برچسب گذاری پروب. 4. توانایی طویل شدن پرایمر با نوکلئوتیدهای نشاندار برای افزایش سیگنال c-PRINS هنگام شناسایی توالی های منحصر به فرد کوتاه. برای شناسایی تکرارهای کم کپی یا توالی های منحصر به فرد کوتاه، از روش حساس تری استفاده می شود - PRINS دوچرخه سواری (c-PRINS). C-PRINS توسط Gosden و همکاران پیشنهاد شد. در سال 1991، یک پروتکل بهبود یافته به طور گسترده توسط Kubaláková و همکاران. ، 2001 (Kubaláková M، Vrána J، Cíhalíková J، Lysák MA، Dole J (2001). محلی سازی توالی های DNA روی کروموزوم های گیاهی با استفاده از PRINS و C-PRINS. Methods in Cell Science 23: 71-82). C-PRINS شامل یک سری چرخه حرارتی مشابه PCR است.

مایع غلاف برای ماهی: -BD Bioscience Standard (GM Baerlocher, I Vulto, G de Jong, PM Lansdorp. فلوسیتومتری و FISH برای اندازه گیری طول متوسط ​​تلومرها (flow FISH). 2006. Nature Protocols 1, - 2365 - 2376) -40 متر M KCl + 10 متر. M Na. کلر (Vrána J، Kubaláková M، Simková H، Cíhalíková J، Lysák MA، Dolezel J. مرتب‌سازی جریان کروموزوم‌های میتوزی در گندم معمولی (Triticum aestivum L.). ژنتیک. 2000؛ 156(4): 2033-41-g) . بنابراین 4 بافر بدون دی تیوتریتول (Lj. Li، L. Ma، K. Arumuganathan، YC Song. کروموزوم های مرتب شده با جریان: یک ماده خوب برای نقشه برداری فیزیکی ژن گیاهی. Caryologia. 2006، جلد 59، شماره 2: 99 -103 سدیم 0.1% (وزنی/حجمی) اتوکلاو شده. Cl-50m. M Na. Cl (M Kubaláková، P Kovářová، P Suchánková، J Číhalíková، J Bartoš، S Lucretti، N Watanabe، SF Kianian، J Doležel. مرتب سازی کروموزوم در گندم تتراپلوئید و پتانسیل آن برای تجزیه و تحلیل ژنوم. ژنتیک (52، 170). 823-829) -بافر پلی آمین تثبیت کننده کروموزوم (مایع غلاف حاوی پروتئین) (Darzynkiewics Z, Robinson JP, Crissman H. Flow Cytometry, 2nd Ed. Part B. San Diego, CA. Academic Press, Inc. 1994)

میکروسکوپ های استاندارد امکان بررسی سلول ها را در سطح مولکولی فراهم نمی کنند. یک افزایش قدرتمند به تنهایی در اینجا کافی نیست. تصویربرداری دیجیتال، معرف های اضافی و سایر مواد و ابزار مورد نیاز است. برای تجزیه و تحلیل DNA و RNA در حال حاضر از روشی استفاده می شود که به آن هیبریداسیون درجا می گویند. از آنجایی که شامل رنگ‌آمیزی نمونه‌ها و سپس آنالیز تابشی است، هیبریداسیون فلورسانس یا FISH نیز نامیده می‌شود.

هیبریداسیون درجا فلورسنت به طور گسترده در تحقیقات ژنتیکی، تشخیص سرطان، مدیریت بارداری و بسیاری از زمینه های دیگر از علم استفاده می شود. این روش همانطور که از نامش پیداست بر اساس ویژگی مولکول های DNA و RNA برای ایجاد پیوندهای پایدار با پروب ها، یعنی تشکیل مولکول های هیبریدی است. کلمات "In situ" به این معنی است که همه مشاهدات "درجا" انجام می شود، یعنی مستقیماً بدون استفاده از یک رسانه اضافی.

پروب های DNA (پروب ها) مکمل مولکول های نمونه آزمایشی هستند. آنها شامل نوکلئوزیدها هستند که با فلوروفورها (موادی که خاصیت فلورسانس را به مولکول می دهند) برچسب گذاری شده اند. این روش برچسب گذاری مستقیم نامیده می شود. اگر از مولکول های مزدوج هیبریدی به عنوان نشانگر استفاده شود، برچسب گذاری غیرمستقیم به دست می آید. با برچسب زدن مستقیم، هیبریداسیون را می توان در زیر میکروسکوپ فلورسانس بلافاصله پس از تکمیل آن مشاهده کرد. برای برچسب زدن غیر مستقیم، روش رنگ آمیزی دیگری انجام می شود. مولکول های مزدوج را از طریق رنگ از نمونه های مورد مطالعه جدا می کند.

روش هیبریداسیون با برچسب گذاری غیرمستقیم به زمان و معرف های بیشتری نیاز دارد، اما به شما امکان می دهد به نتایج قابل اعتمادتری دست یابید. سطح سیگنال در این حالت بالاتر خواهد بود و علاوه بر این، تقویت مرحله ای آن نیز امکان پذیر است. توالی‌های DNA کلون شده (محصولات PCR، DNA ژنومی، الیگونوکلئوتیدهای نشان‌دار و غیره) به عنوان پروب‌های نشان‌دار استفاده می‌شوند. برچسب گذاری پروب به روش های مختلفی انجام می شود. روش های رایج عبارتند از ترجمه نیک و واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) با نوکلئوتیدهای نشاندار.

ترتیب رویه

روش In situ با یک مرحله آماده سازی - طراحی پروب ها آغاز می شود. ابعاد کاوشگرها نباید آنقدر بزرگ باشد که در فرآیند تحقیق اختلال ایجاد کند. پروب هایی که خیلی کوچک هستند نیز نامطلوب هستند، زیرا نتایج قابل اعتمادی را تضمین نمی کنند. بنابراین، کاوشگرهایی تا اندازه 1000 جفت باز برای تحقیق انتخاب می شوند. اگر پروب DNA دو رشته ای باشد، اسید قبل از هیبریداسیون دناتوره می شود. هنگامی که نتیجه مطلوب به دست آمد (مناطق خاصی از کروموزوم ها یا همه کروموزوم ها رنگ آمیزی می شوند)، هیبریداسیون بیشتر پروب های DNA با توالی های تکرار شونده مسدود می شود. برای انجام این کار، مولکول های تکراری DNA نشاندار نشده به مخلوط هیبریداسیون اضافه می شوند.

مرحله بعدی تحقیق، تهیه آماده سازی هسته های بین فازی یا کروموزوم های متافاز است. سلول ها در زیرلایه روی شیشه ثابت می شوند و پس از آن DNA دناتوره می شود. برای کاهش دمای دناتوراسیون و حفظ مورفولوژی هسته ها و کروموزوم ها، دناتوراسیون با افزودن فرمید انجام می شود. پس از آن، پروب ها به مواد اضافه شده و هیبریداسیون برای چند ساعت انجام می شود. پس از اتمام آن، یک شستشوی چند مرحله ای برای حذف پروب هایی که با مولکول های نمونه متصل نشده اند انجام می شود.

یک روش مدرن تجزیه و تحلیل سیتوژنتیک، که اجازه می دهد تا تغییرات کمی و کیفی در کروموزوم ها (از جمله جابه جایی ها و ریزحذف ها) تعیین شود و برای تشخیص افتراقی بیماری های بدخیم خون و تومورهای جامد استفاده می شود.

مترادف های روسی

هیبریداسیون درجا فلورسنت

تجزیه و تحلیل FISH

مترادف های انگلیسی

فلورسانس در موقعیتهیبریداسیون

روش تحقيق

هیبریداسیون درجا فلورسنت

از چه مواد زیستی می توان برای تحقیق استفاده کرد؟

نمونه بافت، نمونه بافت در بلوک پارافین.

چگونه به درستی برای تحقیق آماده شویم؟

هیچ آمادگی لازم نیست.

اطلاعات کلی در مورد مطالعه

هیبریداسیون درجا فلورسنت (FISH) که در- درجاهیبریداسیون) یکی از مدرن ترین روش ها برای تشخیص ناهنجاری های کروموزومی است. این مبتنی بر استفاده از پروب‌های DNA است که با برچسب فلورسنت نشان‌دار شده‌اند. کاوشگرهای DNA قطعات DNA سنتز شده ویژه ای هستند که توالی آنها مکمل توالی DNA کروموزوم های نابجای مورد مطالعه است. بنابراین، نمونه‌های DNA از نظر ترکیب متفاوت هستند: نمونه‌های مختلف DNA خاص برای تعیین ناهنجاری‌های کروموزومی مختلف استفاده می‌شوند. کاوشگرهای DNA نیز از نظر اندازه متفاوت هستند: برخی ممکن است به کل کروموزوم هدایت شوند، برخی دیگر به یک مکان خاص.

در طول فرآیند هیبریداسیون، اگر کروموزوم های نابجا در نمونه آزمایشی وجود داشته باشد، به پروب DNA متصل می شوند، که با بررسی میکروسکوپ فلورسنت، به عنوان سیگنال فلورسنت (نتیجه مثبت آزمایش FISH) تعیین می شود. در غیاب کروموزوم‌های نابجا، نمونه‌های DNA غیرپیوندی در طول واکنش "شسته می‌شوند" که وقتی با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت بررسی می‌شود، به عنوان عدم وجود سیگنال فلورسنت (نتیجه آزمایش FISH منفی) تعریف می‌شود. این روش امکان ارزیابی نه تنها وجود سیگنال فلورسنت، بلکه شدت و محلی سازی آن را نیز فراهم می کند. بنابراین، آزمون FISH نه تنها یک روش کیفی، بلکه یک روش کمی است.

تست FISH نسبت به سایر روش های سیتوژنتیکی مزایای زیادی دارد. اول از همه، مطالعه FISH را می توان برای هسته های متافاز و بین فاز، یعنی برای سلول های غیرقابل تقسیم اعمال کرد. این مزیت اصلی FISH نسبت به روش‌های کاریوتایپینگ کلاسیک (مثلاً رنگ‌آمیزی کروموزوم‌های رومانوفسکی-گیمسا) است که فقط برای هسته‌های متافاز اعمال می‌شود. این امر FISH را به روشی دقیق‌تر برای تشخیص ناهنجاری‌های کروموزومی در بافت‌هایی با فعالیت پرولیفراتیو کم، از جمله تومورهای جامد تبدیل می‌کند.

از آنجایی که آزمایش FISH از DNA پایدار هسته‌های اینترفاز استفاده می‌کند، طیف گسترده‌ای از بیومواد را می‌توان برای تحقیق مورد استفاده قرار داد - آسپیره‌های بیوپسی آسپیراسیون با زاویه ریز، اسمیر، آسپیراسیون مغز استخوان، نمونه‌های بیوپسی و مهمتر از همه، قطعات بافتی حفظ شده، مانند بلوک‌های بافت‌شناسی. بنابراین، برای مثال، آزمایش FISH می‌تواند با موفقیت روی آماده‌سازی‌های مکرر به‌دست‌آمده از بلوک بافت‌شناسی نمونه بیوپسی پستان هنگام تأیید تشخیص "آدنوکارسینوم پستان" و نیاز به تعیین وضعیت HER2/neu تومور انجام شود. لازم به تأکید است که در حال حاضر مطالعه FISH به عنوان یک آزمایش تأییدی هنگام دریافت یک نتیجه نامشخص از مطالعه ایمونوهیستوشیمی تومور برای نشانگر تومور HER2 / neu (IHC 2+) توصیه می شود.

مزیت دیگر FISH توانایی آن در تشخیص ریزحذف هایی است که با کاریوتایپ کلاسیک یا PCR شناسایی نمی شوند. این امر در موارد مشکوک به سندرم دی جورج و سندرم ولوکاردیو صورت اهمیت ویژه ای دارد.

تست FISH به طور گسترده در تشخیص افتراقی بیماری های بدخیم، عمدتا در انکوهماتولوژی استفاده می شود. ناهنجاری های کروموزومی در ترکیب با تصویر بالینی و داده های ایمونوهیستوشیمی مبنایی برای طبقه بندی، تعیین تاکتیک های درمانی و پیش آگهی بیماری های لنفاوی و میلوپرولیفراتیو هستند. نمونه های کلاسیک عبارتند از لوسمی میلوئید مزمن - t (9؛ 22)، لوسمی حاد پرومیلوسیتیک - t (15؛ 17)، لوسمی لنفوسیتی مزمن - تریزومی 12 و دیگران. در مورد تومورهای جامد، مطالعه FISH اغلب در تشخیص سرطان های سینه، مثانه، روده بزرگ، نوروبلاستوما، رتینوبلاستوما و غیره استفاده می شود.

مطالعه FISH همچنین می تواند در تشخیص قبل از تولد و قبل از لانه گزینی استفاده شود.

آزمایش FISH اغلب در ترکیب با سایر روش های تشخیص مولکولی و سیتوژنتیکی انجام می شود. نتیجه این مطالعه در ارتباط با نتایج داده های آزمایشگاهی و ابزاری اضافی ارزیابی می شود.

تحقیق در چه مواردی کاربرد دارد؟

• برای تشخیص افتراقی بیماری های بدخیم (خون و اندام های جامد).

زمان مطالعه چه زمانی است؟

• اگر به وجود یک بیماری بدخیم خون یا تومورهای جامد مشکوک هستید، تاکتیک های درمان و پیش آگهی آن به ترکیب کروموزومی کلون تومور بستگی دارد.

این نتایج چه معنی ای می دهد؟

نتیجه مثبت:

• وجود کروموزوم های نابجا در نمونه آزمایش.

نتیجه منفی:

• عدم وجود کروموزوم های نابجا در نمونه آزمایش.

چه چیزی می تواند در نتیجه تأثیر بگذارد؟

• تعداد کروموزوم های نابجا



• مطالعه ایمونوهیستوشیمی مواد بالینی (با استفاده از 1 آنتی بادی)
• مطالعه ایمونوهیستوشیمی مواد بالینی (با استفاده از 4 آنتی بادی یا بیشتر)
• تعیین وضعیت تومور HER2 توسط FISH
• تعیین وضعیت تومور HER2 با روش CISH

چه کسی مطالعه را سفارش می دهد؟

انکولوژیست، متخصص اطفال، متخصص زنان و زایمان، متخصص ژنتیک.

ادبیات

• Wan TS، Ma ES. سیتوژنتیک مولکولی: ابزاری ضروری برای تشخیص سرطان ضد سرطان Res. 2005 ژوئیه-اوت؛ 25 (4): 2979-83.
• Koliallexi A، Tsangaris GT، Kitsiou S، Kanavakis E، Mavrou A. تاثیر مطالعات سیتوژنتیک و سیتوژنتیک مولکولی بر بدخیمی های خونی. Chang Gung Med J. 2012 Mar-Apr;35(2):96-110.
• Mühlmann M. سیتوژنتیک مولکولی در سلول های متافاز و اینترفاز برای تحقیقات سرطان و ژنتیک، تشخیص و پیش آگهی. کاربرد در مقاطع بافتی و سوسپانسیون های سلولی. Genet Mol Res. 2002 ژوئن 30؛ 1 (2): 117-27.