Метод на флуоресцентна хибридизация in situ (FISH) при диагностика на хромозомни заболявания. Флуоресцентна хибридизация Флуоресцентна хибридизация

• Флуоресцентната in situ хибридизация или методът FISH (флуоресцентна in situ хибридизация - FISH) е цитогенетичен метод, който се използва за откриване и определяне на позицията на специфична ДНК последователност върху метафазни хромозоми или в интерфазни ядра in situ. В допълнение, FISH се използва за откриване на специфични иРНК в тъканна проба. В последния случай методът FISH дава възможност да се установят пространствено-времеви характеристики на генната експресия в клетките и тъканите.

  Методът FISH се използва в преимплантационна, пренатална и постнатална генетична диагностика, при диагностика на онкологични заболявания, в ретроспективната биологична дозиметрия.

Свързани понятия

Микронуклеус – в цитологията, фрагмент от ядрото в еукариотна клетка, който не съдържа пълния геном, необходим за оцеляването й. Това е патологична структура и може да се наблюдава в клетките на всяка тъкан. Обикновено микроядра се образуват в резултат на анормално клетъчно делене или ядрена фрагментация по време на апоптоза.

Хомоложната рекомбинация или общата рекомбинация е вид генетична рекомбинация, по време на която се обменят нуклеотидни последователности между две подобни или идентични хромозоми. Това е най-широко използвания метод от клетките за възстановяване на двойно- или едноверижно увреждане на ДНК. Хомоложната рекомбинация също създава разнообразие от генни комбинации по време на мейозата, осигурявайки високо ниво на наследствена вариабилност, което от своя страна позволява на популацията да се адаптира по-добре...

Космиди (Cosmides) - плазмиди, съдържащи ДНК фрагмент на ламбда фага, включително cos-сайт. Заедно с опаковъчните системи във фагови частици in vitro, те се използват като векторни молекули за клониране на гени и при конструирането на геномни библиотеки. Космидите са конструирани за първи път от Колинс и Брюнинг през 1978 г. Името им идва от съкращение на два термина: cos-section (самият термин от своя страна идва от английския cohesive ends - лепкави краища) и плазмид.

Поради натрупването на огромно количество информация за генните последователности, в момента често се използват методи за обратна генетика за идентифициране на функциите на гените. Изследователите манипулират генните последователности, променяйки или изключвайки конкретен ген и анализират до какви промени води това. Това е пътят на обратната генетика: от ген към черта/фенотип. Предната и обратната генетика не са взаимно изключващи се подходи, а се допълват взаимно в изследването на генната функция.
(англ. transformation) - процесът на усвояване от бактериална клетка на молекула ДНК от външната среда. За да може да се трансформира, клетката трябва да е компетентна, тоест молекулите на ДНК трябва да могат да проникнат в нея през клетъчните мембрани. Трансформацията се използва активно в молекулярната биология и генното инженерство.

Нехомоложното крайно свързване или нехомоложното крайно свързване (NHEJ) е един от начините за възстановяване на двойни вериги в ДНК. Този процес се нарича нехомоложен, тъй като повредените краища на веригата са свързани директно с лигаза, без нужда от хомоложен шаблон, за разлика от процеса на хомоложна рекомбинация. Терминът "нехомоложно крайно свързване" е предложен през 1996 г. от Мур и Хабер. NHEJ е значително по-малко точен от хомоложната рекомбинация...

Кулините са семейство хидрофобни протеини, които служат като скеле за убиквитин лигази (E3). Всички еукариоти изглежда имат кулини. Те, в комбинация с RING протеини, образуват culin-RING убиквитин лигази (CRL), които са много разнообразни и играят роля в много клетъчни процеси, например протеолиза (те унищожават около 20% от клетъчните протеини), епигенетична регулация и растителен имунитет, медииран от салицилова киселина.

Секвенирането от следващо поколение (NGS) е техника за определяне на нуклеотидната последователност на ДНК и РНК за получаване на официално описание на нейната първична структура. Технологията на методите за секвениране от следващо поколение (NGS) ви позволява да „четете“ няколко секции от генома наведнъж, което е основната разлика от по-ранните методи за секвениране. SNP се провежда с помощта на повтарящи се цикли на индуцирано от полимераза удължаване на веригата или множество...

Quantiferon (понякога quantiferon, quantiferon test; английски QuantiFERON) е търговското наименование на ензимен имуноанализ диагностичен тест за туберкулозна инфекция, произведен от американската компания QIAGEN. Текстът използва ELISA технология за откриване на имунен отговор интерферон гама.

метод на хибридизация на място* (на място, лат.) се основава на способността на ДНК или РНК да образува стабилни хибридни молекули с ДНК/РНК сонди директно върху препарати от фиксирани хромозоми и интерфазни ядра. Използвайки този метод, можете да определите точното местоположение на почти всяка ДНК или РНК последователност директно в клетката, клетъчното ядро ​​или хромозомите.

За хибридизация. на мястоподходящи цитологични или хистологични препарати от клетки от всякакви тъкани или органи, приготвени по стандартни методи. В клинична цитогенетична лаборатория се използват препарати от култивирани лимфоцити от периферна кръв, хорион епителни цитотрофобластни клетки, култивирани и некултивирани клетки от околоплодна течност, различни тъкани от абортен материал, както и намазки от букален епител и кръвни клетки.

метод на хибридизация на място е от особено значение за практическата цитогенетика поради разработването на неизотопен вариант, базиран на използването на сонди, белязани с нерадиоактивни модифицирани нуклеотиди. Неизотопните варианти на хибридизация върху препарати (особено флуоресцентните) имат редица предимства в сравнение с изотопните: висока разделителна способност, която е равна на разделителната способност на микроскоп (0,1 - 0,2 μm), няма нужда от статистическа обработка на резултатите, бързина и безопасност за здравните изследователи

В допълнение, комбинацията от различно модифицирани сонди, открити с помощта на различни системи за откриване, позволява едновременно определяне на местоположението на две или повече ДНК последователности в една клетка или върху една метафазна плоча. А използването на повтарящи се последователности, маркирани с флуорохроми като ДНК сонди, намалява времето на процедурата до 7-9 часа (класическата неизотопна хибридизация отнема два дни, изотопни варианти от седмица до месец), което е особено важно за пренаталната диагностика. Използване FISH методв цитогенетичната диагностика позволява идентифициране на структурни хромозомни пренареждания, установяване на естеството на маркерните хромозоми и анализиране на числени нарушения на хромозомния набор, както на метафазни хромозоми, така и на интерфазни ядра.

Принцип на метода FISH

В основата FISH методсе крие реакцията на хибридизация между изкуствено създадена ДНК проба и нейната комплементарна нуклеотидна последователност на ядрената ДНК. Молекулата на ДНК се състои от две спирални нуклеотидни вериги и хибридизацията е възможна само ако веригите се разделят. За да се разединят нуклеотидните вериги на ДНК, се използва денатурация (за последваща хибридизация трябва да се денатурират както ДНК в ядрата на изследваната проба, така и самата ДНК сонда). След денатурация, ДНК сондата хибридизира с нейната комплементарна нуклеотидна последователност и може да бъде открита с помощта на флуоресцентен микроскоп.

Така общата форма на протокола за настройка РИБАможе да се представи в следната форма:

1. Изготвяне на хистологичен или цитологичен препарат.
Приготвянето на хистологичен препарат се извършва по стандартната схема: изрязване, маркиране, окабеляване, изливане, микротомия, поставяне на разреза върху предметно стъкло и депарафинизация. При приготвянето на цитологичен препарат се използват специални утаяващи разтвори и центрофугиране, което прави възможно получаването на концентрирана клетъчна суспензия.

2. Предварителна обработка (ако е необходимо).
Препаратът се обработва от протеази, за да се елиминира наличието на протеини, които пречат на хибридизацията.

3. Прилагане на ДНК сонда върху препарата и последваща денатурация.
За да се денатурират пробата и ДНК на пробата, те се третират с формамид и се нагряват до температура около 85-90°C.

4. Хибридизация.
След денатурация лекарството се охлажда до определена температура (37°C в случай на клинични изследвания) и се инкубира във влажна камера за няколко часа (продължителността на инкубацията е посочена във всеки конкретен протокол). Понастоящем автоматичните хибридизатори се използват за денатурация и хибридизация.

5. Измиване.
След като хибридизацията приключи, несвързаните сонди трябва да бъдат измити, което иначе би създало фон, който затруднява оценката на резултатите от FISH. За промиване обикновено се използва разтвор, съдържащ цитрат и натриев хлорид (SSC).

6. Противно оцветяване.
С помощта на флуоресцентни багрила (DAPI - 4,6-диамидин-2-фенилиндол; пропидиев йодид) се оцветява цялата ядрена ДНК.

7. Анализ на резултатите с помощта на флуоресцентен микроскоп. Рутинните операции (депарафиниране, предварителна обработка, измиване) могат да бъдат автоматизирани.

* - Материалът е изготвен на базата на информация от отворени източници.

In situ хибридизация на нуклеинови киселини Методът се основава на възможността за образуване на двуверижни хибриди между белязани сонди, изкуствено създадени на базата на едноверижни последователности (рибо- или дезоксирибо-, олиго- или полинуклеотидни) и последователности, комплементарни към тях в мишени - анализирани ДНК или РНК молекули. За идентифициране на местата на хибридизация, ДНК сонда (ДНК сонда) се маркира с репортерна група: ü радиоактивен изотоп, ü флуорохром, ü ензим, който дава петно ​​или луминесцентен продукт, ü хаптен, с който се свързва белязаното тяло, и т.н.

Чрез откриване на хибрид поради наличието на репортерна група в сондата, е възможно - да се оцени броят на гените, кодиращи определен тип РНК, - да се определи дела на нетранскрибирана ДНК в генома, - да се установи връзката на определени гени един с друг - и тяхното точно местоположение в хромозомите. Методът на молекулярна хибридизация има висока чувствителност (малко количество белязана сонда (10 -15 и 10 -19 M) и съответно може да бъде открита нейната комплементарна последователност в целта) и скорост на анализ, което позволява използването на този метод както за изследване дейности и за диагностика на наследствени и инфекциозни болести в медицината, ветеринарната медицина и растениевъдството.

Появата на нови технологии в молекулярната цитогенетика, базирани основно на in situ хибридизация на нуклеинови киселини, значително разшири възможностите на хромозомната диагностика.

Интерфазна цитогенетика: 1. Многоцветни хромозомни ленти (MCB). 2. Флуоресцентна in situ хибридизация (FISH). 3. Комбинация на FISH с други методи: -цитология + FISH; -хистология + РИБИ; -имунофенотипиране + РИБИ (ФИКТАЦИЯ); Метафазна цитогенетика: 1. Твърдо оцветяване на хромозоми (Цяла картина). 2. Сравнителна геномна хибридизация (CGH). 3. Кариотипиране с промяна на цвета (CCK). 4. Многоцветно кариотипиране: Спектрално кариотипиране (SKY); многоцветни РИБИ (M - FISH, M - BAND).

FISH - флуоресцентна in situ хибридизация - е цитогенетичен метод, използван за откриване и локализиране на специфични ДНК последователности върху хромозоми, иРНК и др. Техниката се основава на хибридизацията на флуоресцентно белязана ДНК/РНК сонда с комплементарна ДНК/РНК последователност. Етикетът се открива с помощта на флуоресцентен микроскоп. Методът FISH е въведен преди повече от 30 години. Той стана широко разпространен като метод за физическо картографиране на гени върху хромозоми. По-късно се прилага и в други области на изследвания (в областта на клиничната генетика, репродуктивната медицина, токсикологията, еволюционната биология, сравнителната и клетъчна геномика и хромозомната биология). В момента FISH се използва основно за изграждане на физически и генетични карти на хромозоми, за откриване на структурни пренареждания, транслокации, микроделеции, генни амплификации в интерфазни и метафазни хромозоми. В резултат на напредъка в науката (по-добро разбиране на химичните и физичните свойства на нуклеиновите киселини и хроматина), както и развитието на флуоресцентната микроскопия и дигиталните изображения, методът непрекъснато се усъвършенства (подобрения в чувствителността, специфичността, разделителната способност) и са разработени много вариации на този метод.

1) Клетките се пускат върху предметно стъкло, което води до разпространение на хромозомите. 4) Хромозомите се оцветяват с помощта на DAPI 2) Флуоресцентно маркирана сонда се поставя върху хромозомите и се запечатва. 3) Сондата и хромозомите се денатурират, хибридизират и след това се промиват 5) Слайдът се разглежда под флуоресцентен микроскоп

Общата форма на протокола за създаване на FISH може да бъде представена по следния начин: 1. Изготвяне на хистологичен или цитологичен препарат. Приготвянето на хистологичен препарат се извършва по стандартната схема: изрязване, маркиране, окабеляване, изливане, микротомия, поставяне на разреза върху предметно стъкло и депарафинизация. При приготвянето на цитологичен препарат се използват специални утаяващи разтвори и центрофугиране, което прави възможно получаването на концентрирана клетъчна суспензия. 2. Предварителна обработка (ако е необходимо). Препаратът се обработва от протеази, за да се елиминира наличието на протеини, които пречат на хибридизацията. 3. Прилагане на ДНК сонда върху препарата и последваща денатурация. За да се денатурират пробата и ДНК на пробата, те се третират с формамид и се нагряват до температура около 85-900 С.

4. Хибридизация. След денатурация лекарството се охлажда до определена температура (370 С в случай на клинични изследвания) и се инкубира във влажна камера за няколко часа (продължителността на инкубацията е посочена във всеки конкретен протокол). Понастоящем автоматичните хибридизатори се използват за денатурация и хибридизация. 5. Измиване. След като хибридизацията приключи, несвързаните сонди трябва да бъдат измити, което иначе би създало фон, който затруднява оценката на резултатите от FISH. За промиване обикновено се използва разтвор, съдържащ цитрат и натриев хлорид (SSC). 6. Противно оцветяване. С помощта на флуоресцентни багрила (DAPI - 4, 6-диамидин-2 фенилиндол; пропидиев йодид) се оцветява цялата ядрена ДНК. 7. Анализ на резултатите с помощта на флуоресцентен микроскоп. Рутинните операции (депарафинизация, предварителна обработка, измиване) могат да бъдат автоматизирани.

Изследване на теломерни области с помощта на флуоресцентен микроскоп. Изображенията, получени на етапа на интерфаза (ядро) и метафаза (отделни хромозоми), се комбинират. син цвят - DAPI.

Предимства на FISH-метода: 1. Възможност за изследване на генетичен материал в интерфазни ядра; 2. Получаването на обективни резултати на база да/не е количествен метод 3. Сравнително проста интерпретация на резултатите висока разделителна способност Недостатъци на метода FISH: 1. Флуоресцентните багрила бързо „избледняват“ микроскоп.

Методът FISH се основава на реакцията на хибридизация между ДНК сонда, създадена по специални технологии, която представлява нуклеотидна последователност с ограничен размер, и комплементарна секция от ядрената ДНК на изследвания цитогенетичен препарат. ДНК сондата е основният елемент за създаване на FISH и носи "етикет", т.е. съдържа нуклеотиди, които са директно свързани с флуорохром или хаптен за по-нататъшна визуализация от антитела, носещи флуорохром. Несвързаната белязана ДНК се измива и след това хибридизираната ДНК проба се открива с помощта на флуоресцентен микроскоп.

ДНК етикетирането се разделя на пряко и непряко. Директното етикетиране въвежда репортерни елементи в ДНК - флуорохроми (родамин, диетиламинокумарин, тексаско червено и др.). Метод на индиректно маркиране - ДНК проба се конюгира предварително с междинни лиганди (биотин, диоксигенин, 2, 4-динитрофенол), чието присъствие върху цитологичен препарат след това се открива с помощта на флуорохроми. В този случай чувствителността на метода се увеличава значително, тъй като лигандът може да съдържа няколко места на взаимодействие с флуорохрома. In situ хибридизация с 32 P-белязана сонда е описана за първи път през 1969 г. Разработването на нерадиоактивни системи за маркиране и откриване на ДНК сонди направи метода за in situ хибридизация безопасен, лесен за изпълнение и по-малко трудоемък при обработката на резултатите. Флуоресцентните багрила са меки и лесни за използване, могат да се съхраняват за неопределено време, дават висока разделителна способност и позволяват едновременно изследване на множество ДНК последователности.

Сонди: едноверижни/двуверижни ДНК/РНК първични/вторично белязани сонди. Пробите се маркират: 1) директно: чрез вмъкване на нуклеотиди, към които е прикрепен флуорохром (PCR или ник транслация) 2) чрез репортерна молекула (напр. дигоксигенин, биотин), към която са прикрепени флуоресцентно белязани антитела. За да подобрите сигнала, можете да използвате вторични, третични и т.н. антитела, белязани с флуоресцентен етикет. ДНКаза прорязва ДНК Nick Translation ДНК полимераза I добавя нови нуклеотиди към 3' хидроксил ДНК полимераза I премахва отделни бази от 5' крайната хромозомна образна картина: като се използва DAPI (2 mg/ml). 4',6-диамидино-2-фенилиндол; силно свързване към богати на A-T ДНК региони; възбуждане с UV светлина; емисия 461 nm (синьо).

Понастоящем има няколко основни подхода, които се използват широко от съвременната молекулярна цитогенетика: Идентифициране на материала на разширени хромозомни региони и цели хромозоми. Откриване в областта на интерес на специфична ДНК последователност. Анализ на дисбаланса на отделните хромозомни области. За идентифициране на материала на разширени хромозомни региони и цели хромозоми широко се използват хромозомно-специфични и специфични за региона ДНК сонди („проби за рисуване“).

Характеристики на различните видове сонди 1. Локус-специфични сонди (LSI - локус - специфични идентификатори, които се свързват с определени области на хромозомите.) Тези сонди се използват за идентифициране на наличната къса (неповтаряща се) последователност от изолирана ДНК, която се използва за приготвяне на белязана сонда и нейната последваща хибридизация с набор от хромозоми. Те са предназначени да откриват диагностично и прогностично значими хромозомни аберации при различни патологични състояния (монозомия и тризомия за отделни хромозоми). Най-широко разпространеното използване на тези проби е получено в пренаталната цитогенетична диагностика, особено при изследванията на клетките на хорионната тъкан и интерфазните ядра на амниоцитите.

2. ДНК сонди към теломерни участъци на хромозомите (TEL telomericprobe) са предназначени да откриват делеции и пренареждания, засягащи крайните участъци на хромозомните рамена. Такива сонди са специфични за p- или q-рамена на хромозомите и са комплементарни към област с дължина около 300 kb. от края на хромозомата. По правило ДНК сондите за къси и дълги рамена на хромозоми са свързани с различни флуорохроми, което прави възможно откриването на двата теломерни области на хромозомата на един цитогенетичен препарат.

3. Центромерни повторни сонди, алфа или хромозомни числители (CEP - centromere. Enumeration. Probe) са специфични за хромозомите ДНК сонди, представени от последователности от тандемни алфа и бета сателитни повторения. Тези повторения са локализирани предимно в центромерните или перицентромерните хетерохроматинови области на хромозомите. С тяхна помощ всяка хромозома може да бъде боядисана в различен цвят, което ви позволява бързо да определите броя на хромозомите и отклоненията от нормалния им брой, допълващи отделни участъци от хромозомата, но като цяло покриващи цялата й дължина. Използвайки библиотека от такива сонди, човек може да "оцвети" цялата хромозома и да получи диференциален спектрален кариотип на индивид. Този тип анализ се използва за анализ на хромозомни аберации, като транслокации, когато част от една хромозома се прехвърля в рамото на друга.

Приложения FISH се използва широко за решаване на следните клинични диагностични задачи: 1. Перимплантация пренатална и диагностика на хромозомни аномалии. Използва се в клиники за ин витро оплождане (IVF) и перинатални центрове. Позволява своевременно (преди имплантиране на ембриона в случай на IVF или в ранните етапи на развитие на плода) да се идентифицират генетични нарушения в нероденото дете и да се вземат необходимите мерки. 2. Онкохематология. Онкохематологичните заболявания възникват в резултат на различни хромозомни аберации, поради което за тяхната диагностика се използват подходящи CEP и LSI сонди. 3. Диагностика на солидни тумори. В момента се установяват все повече причинно-следствени връзки между развитието на специфични ракови заболявания и специфични промени в генома за тях. Следователно, когато се използват подходящи ДНК сонди, е възможно да се извърши онкологична FISH диагностика.

Интерфазна цитогенетика: Комбинация на FISH с други методи: - Имунофенотипиране на FISH (FICTION); + ФИКЦИЯ (Флуоресцентно имунофенотипиране и интерфазна цитогенетика като инструмент за изследване на неоплазми) - за изследване на туморни клетки. За този анализ се използват неоцветени намазки от кръв, костен мозък или препарати от други тъкани. Етап 1 - препаратите се инкубират със специфични моноклонални антитела, етап 2 - конюгиране с флуорофори се извършва за последваща визуализация на комплекса антиген-моноклонално антитяло. Етап 3 - извършване на in situ хибридизация с ДНК сонди. Флуорофори, които се различават по цвят, се използват за откриване на моноклонални антитела и ДНК сонди. Изследването на препарата под флуоресцентен микроскоп с необходимия набор от филтри позволява едновременен анализ на имунофенотипа на хибридизацията и сигналите в интерфазните ядра.

Хромозомна делеция на TNFAIP 3 в c. HL се открива чрез интерфазна цитогенетика. ФЕКЦИЯ анализи на. представител c. HL случаи комбинирани. CD 30 експресия (червено) и FISH сонди за TNFAIP 3 и центромер на хромозома 6 (синьо [b]). В двуцветните анализи в A–C и E и F, сондата TNFAIP 3 е маркирана в зелено (g); в трицветния анализ, приложен в D, сондата TNFAIP 3 дава g/оранжев колокализиран (co) сигнал. Две различни стратегии се използват за показване на двоен и троен цвят FISH анализи в комбинация с CD 30 имунофлуоресценция; и д. , двуцветните анализи (A–C и E и F) са показани с помощта на трицветен дисплей, докато фалшив многоцветен дисплей, получен от софтуера Isis, се прилага за тройния анализ (D), за да покаже едновременно четири цвята ( т.е., CD 30 [r], TNFAIP 3 [g] и оранжево, и центромер на хромозома 6 [b]).

Цифровото записване на микроизображения отвори възможността за преобразуване в псевдоцветове не само комбинации от флуорофори, но и техните съотношения, интензитети

Многоцветно оцветяване на хромозоми (Muli. Color Banding - MSV) Този метод не е предназначен за пълен анализ на всички хромозоми, а за подробен анализ на една хромозома. Специфичните за локуса ДНК сонди са маркирани с различни флуорофори или комбинации от флуорофори, така че нивото на сигнала на всяка от ДНК сондите да варира по интензитет. Припокриващите се профили на интензитета на сигналите на ДНК сондата осигуряват вариации в съотношенията на интензитетите на флуоресценция на различни флуорофори по протежение на хромозомата. Съотношенията на интензитета могат да бъдат преведени в псевдоцветове и по този начин всяка точка от изображението и следователно всеки от хромозомните локуси ще има свой собствен псевдоцвят. Тази версия на многоцветния метод FISH се оказа много ефективна при анализа не само на интерхромозомни, но и на интрахромозомни пренареждания при онкологични заболявания. За успешното му прилагане обаче е необходимо първо да се определи хромозомата, която ще бъде изследвана. Този метод на молекулярна цитогенетика е подходящ за анализ на кариотипни нарушения, свързани с определени хромозоми.

Към днешна дата са създадени набори от ДНК сонди, които осигуряват MCV за всички човешки хромозоми на хромозома 5; многоцветни ленти на хромозома 5; идиограма на хромозома 5; флуорохроми, използвани за MSV).

Метафазната цитогенетика, която исторически е възникнала по-рано от интерфазната цитогенетика, позволява да се определи широк спектър от хромозомни нарушения, но за това е необходимо изследваните клетки да са в метафазния стадий на мейоза.

Многоцветно кариотипиране Анализът се извършва с помощта на ДНК сонди с непрекъснато оцветяване на ръцете или цели хромозоми (WCP сонди - боя за цяла хромозома). Такива сонди хибридизират с множество къси ДНК последователности, разположени по цялата дължина на хромозомата. По този начин, когато се гледа под флуоресцентен микроскоп, хромозомата изглежда равномерно оцветена в определен цвят.

ДНК сондите, използвани за този анализ, се състоят от смес от твърди сонди за оцветяване за пълния набор от човешки хромозоми, белязани с комбинация от няколко флуорохрома, чието съотношение се избира индивидуално за всяка двойка хромозоми. Използването на подходящи методи за регистрация и компютърни програми за анализ на изображението, които оценяват интензитета на луминесценцията на всички флуорохроми за всяка точка на изображението, дава възможност за извършване на кариотипиране, при което всяка двойка хромозоми има свой собствен уникален "псевдоцвет". ".

M-FISH (multitarget multifluor multicolor или multiplex. FISH) е общото име за традиционните многоцветни FISH, използващи специфични за флуорохром набори филтри. Принципът M-FISH се състои в отделно цифрово записване на сигнала на всички използвани флуорохроми, което се постига чрез последователна смяна на комплекти филтри. Всички изображения се записват в отделни файлове, което прави възможно извършването на тяхната ефективна обработка, свързана с разделяне на сигнала и фона, както и количествено определяне на сигнала. Обработката на цялата записана информация с помощта на специален софтуер превежда информацията за нивото на флуорохромните сигнали във всяка точка на изображението в псевдоцветове. Едно от основните ограничения на броя на използваните ДНК сонди е броят на наличните флуорохроми с неприпокриващи се възбуждащи и емисионни спектри и наличието на подходящи комплекти филтри.

24-цветна FISH Най-широко използваната M-FISH е 24-цветна FISH за едновременно идентифициране на материал от всички човешки хромозоми. Той е много ефективен при откриване на хромозомни транслокации, но не е предназначен за откриване на делеции и инверсии. Този проблем обаче може да бъде частично решен чрез едновременно оцветяване на хромозоми с DAPI, което прави възможно анализирането на диференциалната набраздяване на хромозомите, чийто хромозомен материал вече е идентифициран. За съжаление, трябва да се отбележи, че качеството на хромозомната DAPI лента след M-FISH е значително по-ниско от GTG диференциалното оцветяване и дори DAPI лентите след конвенционална in situ хибридизация.

Rx. FISH Принципът M-FISH е използван за генериране на многоцветен баркод за човешки хромозоми и метод на многоцветно хромозомно обвързване, базиран на междувидова in situ хибридизация. За разлика от 24 цвята FISH, този метод дава възможност за директно откриване на част от интрахромозомните пренареждания. ДНК сонди, използвани в Rx. FISH, етикетирана с комбинация от 3 флуорохрома, която осигурява 7 псевдо цвята. Те специално оцветяват отделни области на хромозомите, създавайки тяхната цветна ивица. Тази характеристика на ДНК проби за Rx. РИБИТЕ се определят от начина, по който са получени. Те са специфични за хромозомите ДНК библиотеки на два вида гибони: Hylobates concolor и Hylobates syndactylus.

В резултат на интензивните хромозомни пренареждания, настъпили при формирането на съвременните видове гибони, материалът на техните хромозоми се оказа силно разбъркан в сравнение с организацията на хромозомите при хората, чиито хромозоми са известни със своя консерватизъм. Съотношението на човешката хромозома 1 към гибон хромозомите е показано на фигура 1,

Фигура 2 показва общ изглед на човешки хромозоми, получени в резултат на Rx. РИБА. а) Метафазна плочка б) Подреждане на хромозомите.

Въпреки това, RXFISH има сериозни ограничения - хромозомните пренареждания, които са се случили в рамките на една цветна RX лента, не могат да бъдат открити с помощта на този метод, освен ако не доведат до значителни и лесно видими промени в размера на тази лента. - сондите оцветяват няколко хромозомни области на различни хромозоми в един псевдоцвет. Въпреки това, тъй като броят на използваните флуорохроми се увеличава, методът RXFISH несъмнено ще бъде по-информативен от рутинния 24-цветен FISH.

Предимствата на RXFISH в момента включват следните точки: Методът позволява анализ на целия човешки геном в един многоцветен FISH експеримент. Предлагат се в търговската мрежа набори от белязани ДНК сонди и необходимите системи за откриване. Методът позволява бързо идентифициране на значителна част от интра- и интерхромозомните пренареждания. Възможна е автоматична идентификация на метафазни хромозоми с „цветни ленти“. Всяка човешка хромозома има уникален цветен баркод. RXFISH е интегриран в работната станция Cyto. Системи за зрение и стандартна флуоресцентна микроскопия.

Спектрално кариотипиране (SKY-спектралкариотипиране) Основните принципи на анализа на микроскопични изображения при спектралното кариотипиране са практически същите като тези, използвани в M-FISH. Разликите са свързани с начина на регистриране на изображението. Технологията SKY ви позволява да получите спектрални криви за всички точки на изображението по време на едно измерване, независимо дали е свързано с епифлуоресценция или с традиционна светлинна микроскопия. За спектрално кариотипиране на всички човешки хромозоми се използват пет флуорохрома, един в зеления спектър, два в червения и два в инфрачервения. Възбуждането и излъчването на всички флуорохроми, използвани при етикетирането на ДНК сонди, се осъществява с един набор от филтри, което позволява да се избегне тяхната последователна промяна, междинно фокусиране и следователно свързани проблеми, като пространствено изместване на изображението, определяне на праговите стойности. и маски за сегментиране. Въз основа на анализа на спектралните криви се определя наличието или отсъствието на специфични флуорохроми в дадена точка.

Следващата стъпка е процедурата за класификация, която ви позволява директно и недвусмислено да определите хромозомната принадлежност на анализирания материал. Това гарантира надеждна идентификация (до хромозомата) на маркерния хромозомен материал, както и на производните на хромозомите, произтичащи от различни пренареждания. Голямото предимство на SKY е, че DAPI оцветяването се регистрира успоредно на спектралното изображение. Софтуерното подобрение на DAPI лентата прави възможно постигането на диференциално набраздяване в качество, близко до това на GTG лентите. Възможността за паралелен анализ на спектралното изображение и качествено диференциално оцветяване на хромозомите значително опростява интерпретацията на резултатите от SKY и позволява по-точно определяне на точките на хромозомни прекъсвания. Несъмнените предимства на SKY включват възможността за използване на флуорохроми с припокриващи се спектри на възбуждане и излъчване, което значително разширява списъка на използваемите флуорохроми, а също така увеличава броя на флуорохромите, които могат да се използват едновременно. Изброяването на нов флуорохром не изисква закупуването на нов комплект филтри, тъй като един филтърен блок за спектрална FISH и един филтър за DAPI са достатъчни за SKY.

Недостатъците на SKY включват: - дълго време на експозиция, необходимо за записване на микроскопични изображения. - SKY е малко по-малко ефективен от M-FISH, когато става въпрос за изследвания с относително малки ДНК сонди.

Кариотипиране с промяна на цвета (CCKs Кариотипиране с промяна на цвета) Този метод се основава на анализа на разликата в дължината на сигнала между ДНК проби, хибридизирани с ДНК сонди, свързани с флуорохроми, и ДНК сонди, носещи антитела. Методът е осъществим само с 3 филтъра и не изисква специални камери и софтуер. За идентифициране на хромозоми се извършва една хибридизация и се получават две изображения. Методът се основава на разликата в дължината на флуоресцентния сигнал, тъй като времето на експозиция на ДНК проби, свързани с антитела, е с 80 - 90% по-малко от това на пробите, свързани с флуорохроми. След реакцията на хибридизация, тампоните се излагат на съответните първични антитела и след това се визуализират, за да се получи първото изображение. След това слайдовете се излагат на вторични антитела и авидин, свързан със същите флуорохроми. Штрихите могат да бъдат противооцветени с помощта на DAPI.

В бъдеще изображенията на препаратите отново се получават с помощта на 3 филтъра на свой ред. Тези изображения се сравняват с помощта на специален софтуер и се получава второ изображение, в което ще се виждат само хромозомите, свързани с определени антитела. По този начин някои хромозоми ще флуоресцират само на първото или второто изображение, докато други ще променят цвета си на различни изображения.

Сравнителна геномна хибридизация (CGH) Методът е създаден за идентифициране на количествени нарушения в генома. Тя се основава на провеждане на реакция на хибридизация in situ, използвайки целия геном като ДНК проба. Изолираната и нормална донорна ДНК се маркира с флуорохроми с различни цветове, като по този начин се превръща в ДНК сонди. Еквивалентни количества от тези сонди се смесват и се използват при хибридизация с контролен цитогенетичен препарат. След FISH метафазите се анализират на флуоресцентен микроскоп, като се използва специализирана програма за компютърен анализ на изображения за определяне на интензитета на флуоресценция на два флуорохрома по цялата дължина на всяка хромозома.

При липса на количествени промени в кариотипа на тестовата проба ще се наблюдава определено съотношение на интензитета на луминесценция на двата флуорохрома. В случай на амплификация на гена, интензитетът на сигнала на съответния флуорохром ще се увеличи, а в случай на загуба на част от генетичния материал, напротив, ще отслабне. По този начин CGH прави възможно откриването на геномен дисбаланс, но този метод не може да се използва за откриване на балансирани транслокации и инверсии, а тризомиите и делециите могат да бъдат открити само ако размерът на небалансирания регион е най-малко 10 милиона базови двойки.

Хромозомният дисбаланс в тестовата проба се оценява от разликата в интензитета на флуоресценция на два различни флуорохрома чрез изчисляване на флуоресцентното съотношение (FR).

Методът CGH има редица предимства пред други методи за анализиране на промените в генома: Първо, той не зависи от източника на тестовия материал и може успешно да се извърши с малко количество тествана ДНК, включително архивен материал. Второ, позволява получаването на подробна информация за загубата или увеличаването на броя на копията на генетичен материал в целия геном в един експеримент. На трето място, методът на CGH не изисква подготовка на препарати от метафазни хромозоми от изследваната тъкан, тоест не зависи от процеса на клетъчна култура и свързани артефакти.

Геномна ситу хибридизация (genomicin situ hybridization in, GISH) е вариант на метода на ситу хибридизация, който се състои във факта, че за хибридизация с фиксирани проби, общата геномна ДНК на един вид организъм се използва като флуоресцентно белязана сонда, с с което се конкурира общата геномна ДНК на друг вид организми; използва се за определяне на междувидови и вътрешновидови разлики в геномите, хромозомни пренареждания, делеции и замествания.

FISH вариации 1) Q-FISH – количествен FISH: Разработено от Lansdorp et al: U. M. Martens, J. M. Zijlmans, S. S. Poon, W. Dragowska, J. Yui, E. A. Chavez, R. K. Ward и P. M. Lansdorp. 1998. Къси теломери на човешка хромозома 17 стр. Нац. Genet. 18:76-80. количествен метод. Проектиран за работа с поточна цитометрия. Първоначално се използва за измерване на дължината на хромозомата (резолюция: 200 bp) чрез преброяване на броя на теломерните повторения. Използват се PNA-конюгирани сонди. Първоначално бяха изследвани метафазни хромозоми (QFISH собствено), сега този метод е приложим и за интерфазни хромозоми (IQ-FISH). Q-FISH се провежда върху клетъчна култура, тъканни срезове (и двете върху очила). В момента Q-FISH е важен инструмент в изследването на ролята на теломерите в процесите на стареене и образуване на рак.

PNA-FISH - Пептидни нуклеинови киселини FISH: Пептидните нуклеинови киселини (PNAs) са синтетични аналози на ДНК, в които захарният гръбнак на дезоксирибозния фосфат, който поддържа азотната основа, е заменен от незареден пептиден гръбнак. В резултат на тази структура: не настъпва електростатично отблъскване, когато PNA-олигомерната проба хибридизира с комплементарна ДНК/РНК. Дуплексите на PNA-DNA (PNA-RNA) са много по-стабилни от естествените хомо/хетеродуплекси. Висока специфичност на свързването на PNA-DNA: хибридизацията на PNA-DNA е много по-чувствителна към несъответствие на базовите двойки, отколкото хибридизацията на ДНК-ДНК. По този начин, използвайки PNA сонда, могат да се разграничат два центромерни повторения, които се различават само в една базова двойка. PNA има относителна хидрофобност (в сравнение с ДНК), в резултат на което PNA дифундира по-добре през клетъчните стени => широко приложение в микробиологията. Въз основа на високата специфичност на свързване: смята се, че PNA технологията скоро ще стане основа за създаването на алел-специфични сонди за in situ хибридизация. Използва се в генетиката, цитогенетиката, епигенетиката, микробиологията и др.

3) Flow-FISH - FISH за поточна цитометрия: Предложено през 1998 г. от: Rufer, N., Dragowska, W., Thornbury, G., Roosnek, E. & Lansdorp, PM Динамика на дължината на теломерите в субпопулациите на човешки лимфоцити, измерена чрез потока на потока . природа биотехнология. 16, 743–747 (1998). Комбинация от Q-FISH и поточна цитометрия, която позволява анализ (измерване) и сортиране на сигнала. За flow-FISH се използва клетъчна суспензия (за измерване на дължината на хромозомните теломери), хромозомни разпределения и изолирани хромозоми (за по-нататъшно картографиране). Както при Q-FISH, се използват PNA-маркирани теломерни сонди (например за изобразяване и измерване на дължината на теломерните повторения).Основното предимство е по-бърз метод (анализ/сортиране на голям брой клетки/хромозоми). Той се използва широко за изследване на различни проблеми: стареене, запазване на теломерите, изследване на суспензии на хематопоетични стволови клетки ex vivo, изследване на бактерии.

Мултипараметричният анализ позволява диференциране на клетъчни типове в рамките на една проба, позволявайки вътрешен контрол и анализ на левкоцитни подтипове.

Предимства на flow-FISH: Лесно възпроизводими резултати Възможност за анализиране на подгрупи от клетки в популация с помощта на физическа имунофлуоресценция и маркери По-добра производителност от Q-FISH Възможност за количествено определяне на флуоресценцията на хиляди клетки.

ИЗСЛЕДВАНЕ НА ИЗОЛИРАНИ ХРОМОЗОМИ ЧРЕЗ ПРОТОЧНА ЦИТОМЕТРИЯ 1. Сортиране на хромозоми чрез поточна цитометрия - Кариотипирането чрез проточна цитометрия се използва за по-нататъшно генно картографиране и изграждане на хромозомни библиотеки. - Идентификацията и локализацията на гени върху сортирани хромозоми се извършва с последващо използване на FISH методи / PRINS метод (primed in situ маркиране) или негови вариации и хромозомно-специфичен PCR. - До 2011 г. досега са успешно сортирани само хромозомите на 17 вида културни растения. - Сортиране на метафазни или пахитени хромозоми с висок индекс на делене.

Флуоресцентно етикетиране: - Хромозомите са белязани със специфични за нуклеинова киселина флуорохроми. - Флуорохромите се избират в съответствие с 1) специфичност за азотни основи, 2) експериментални условия (включително като се вземат предвид дължините на вълната на наличните лазери). 1. За моновариантен анализ използвайте багрила, които не са специфични за AT или GC пари: пропидиев йодид (пик на възбуждане: 535 nm, емисии: 617 nm, необходим лазер: 488 nm аргонов лазер или лампа + дългопропускащ филтър) етидиев бромид ( пикове на възбуждане: : 300 и 520 nm, емисии: 600 nm, необходим лазер: 488 nm аргонов лазер или лампа + дългопропускащ филтър) Тези етикети оцветяват ДНК, независимо от съдържанието на A, G, T или азотни основи. 2. За бивариатен анализ използвайте: хромомицин (специфичен за G-C базови двойки), пик A 3 възбуждане: 458 nm, емисия 580 nm. Лазер: , 458 nm минимум 400 m. V мощност. Hoechst 33258 (специфичен за A-T bp), възбуждане: 351-364 nm, излъчване: 470 nm. Лазер: 351 -364 nm (мощен). Лазерите трябва да бъдат разделени във времето и пространството поради частичното припокриване на флуорохромните спектри.

2. Изследване на хромозоми/нуклеотидни последователности след сортиране (за изграждане на физически и генетични карти и др.) FISH BAC-FISH PRINS C-PRINS Изследване на големи геноми с дълги хромозоми. Картиране на последователности с голям брой повторения (напр. теломерни и центромерни области). Използване на къси сонди. Поради големия брой повторения сигналът е силен. Стандартен размер на сондата: 15 - 30 нуклеотида. РИБА

Проблеми с FISH: Трудно е да се локализират еднолокусни ДНК последователности (т.е. неповтарящи се уникални ДНК последователности), тъй като сигналът ще бъде много слаб, когато се използват стандартни къси сонди. Увеличаването на дължината на сондата до няколко килобази за подобряване на сигнала ще доведе до намалена чувствителност и => неспецифично свързване. Решение: BAC-FISH -BAC-FISH е комбинация от метода FISH и използването на геномни ДНК клонове, вградени в бактериални изкуствени хромозоми (BACs), което позволява вмъкването на големи ДНК последователности. - Ефикасен метод за идентифициране и картографиране на отделни хромозоми на организми с малки геноми. BAC сонди, overgos (припокриващи се олигонуклеотиди) се използват като сонда.

Алтернатива на FISH: PRINS PRINS (маркиране in situ) е метод за маркиране на хромозоми чрез отгряване на олигонуклеотиден ДНК праймер с хомоложна последователност от денатурирана хромозомна ДНК и последващо ензимно удължаване на праймера in situ с белязани нуклеотиди. Първо описан от Koch et al. през 1989 г. (Koch, JE, Kølvraa, S., Petersen, KB, Gregersen, N., and Bolund, I. (1989) Методи за праймиране на олигонуклеотиди за хромозомно-специфично маркиране на алфа сателитна ДНК in situ. Хромозома 9598, 2 –265). PRINS е алтернатива на FISH. Използва се за локализация на нуклеотидни последователности, разпознаване и преброяване на метафазни или интерфазни хромозоми или хромозомни двойки (включително хромозомна анеуплоидия). отгряване на немаркирания праймер (праймер-праймер) с ДНК от интерес; удължаване на праймера с помощта на термостабилна ДНК полимераза и белязани нуклеотиди; прекратяване на реакцията (прикрепване на блокираща молекула към 3'-края) Праймер: PCR рестрикционен фрагмент; - индиректен (биотин/диг флуорохром-конюгиран авидин/анти-диг) - Само една двойка хомоложни хромозоми (една хромозома) може да бъде идентифицирана в резултатите от всяка PRINS реакция. Следващата PRINS реакция на същия слайд може да се извърши само след блокиране на предишната. - Използва се за ДНК последователности с голям брой повторения.

Предимства на PRINS: 1. Изисква минимална информация за последователността, необходима за синтеза на олигонуклеотиден праймер. 2. Най-бързият и прост метод за откриване на интересна последователност на хромозома (в сравнение с използването на тежки FISH сонди, които хибридизират за много дълъг период от време). 3. Изключване на стъпката за етикетиране на сондата. 4. Способността за удължаване на праймера с белязани нуклеотиди за подобряване на c-PRINS сигнала при откриване на къси уникални последователности. За идентифициране на повторения с ниска копия или къси уникални последователности се използва по-чувствителен метод - цикъл на PRINS (c-PRINS). C-PRINS е предложен от Gosden et al. през 1991 г., подобрен широко използван протокол от Kubaláková et al. , 2001 (Kubaláková M, Vrána J, Cíhalíková J, Lysák MA, Dole J (2001). Локализация на ДНК последователности върху растителни хромозоми с помощта на PRINS и C-PRINS. Methods in Cell Science 23: 71-82). C-PRINS включва серия от термични цикли, подобни на PCR.

Обвивна течност за FISH: -BD Bioscience Standard (GM Baerlocher, I Vulto, G de Jong, PM Lansdorp. Проточна цитометрия и FISH за измерване на средната дължина на теломерите (flow FISH). 2006. Nature Protocols 1, - 2365 – 2376) -40 м. M KCl + 10 m. M Na. Cl (Vrána J, Kubaláková M, Simková H, Cíhalíková J, Lysák MA, Dolezel J. Поточно сортиране на митотични хромозоми в обикновена пшеница (Triticum aestivum L.). Genetics. 2000; 156(4): 2033-41) -M . Така че 4 буфера без дитиотреитол (Lj. Li, L. Ma, K. Arumuganathan, YC Song. Flow-сортирани хромозоми: фин материал за физическо картиране на растителни гени. Caryologia. 2006, том 59, бр. 2: 99 -103 ) -автоклавиран 0,1% (тегло/обем) Na. Cl-50m. M Na. Cl (M Kubaláková, P Kovářová, P Suchánková, J Čihalíková, J Bartoš, S Lucretti, N Watanabe, SF Kianian, J Doležel. Сортиране на хромозоми в тетраплоидна пшеница и нейният потенциал за анализ на генома. Генетика, 1705 г., 2005 г. 823–829) -Хромозомно-стабилизиращ полиаминов буфер (течност на обвивката, съдържаща протеин) (Darzynkiewics Z, Robinson JP, Crissman H. Flow Cytometry, 2nd Ed. Part B. San Diego, CA. Academic Press, Inc. 1994)

Стандартните микроскопи не дават възможност за изследване на клетките на молекулярно ниво. Само мощно увеличение тук не е достатъчно. Необходими са цифрови изображения, допълнителни реагенти и други материали и инструменти. За анализа на ДНК и РНК в момента се използва метод, който се нарича In situ хибридизация. Тъй като включва оцветяване на проби, последвано от радиационен анализ, се нарича още флуоресцентна хибридизация или FISH.

Флуоресцентната In situ хибридизация се използва широко в генетичните изследвания, диагностиката на рак, управлението на бременността и много други области на науката. Методът, както подсказва името, се основава на свойството на ДНК и РНК молекулите да образуват стабилни връзки със сонди, тоест да образуват хибридни молекули. Думите "In situ" означават, че всички наблюдения се извършват "in situ", тоест директно без използването на допълнителна среда.

ДНК сондите (сондите) са комплементарни към молекулите в тестовата проба. Те включват нуклеозиди, които са белязани с флуорофори (вещества, които придават на молекулата свойството на флуоресценция). Този метод се нарича директно етикетиране; ако хибридни конюгатни молекули се използват като маркери, се получава индиректно маркиране. При директно маркиране хибридизацията може да се наблюдава под флуоресцентен микроскоп веднага след нейното завършване. За индиректно маркиране се извършва друга процедура на оцветяване. Той отделя конюгатните молекули от изследваните проби по цвят.

Методът на хибридизация с индиректно маркиране изисква повече време и реагенти, но ви позволява да постигнете по-надеждни резултати. Нивото на сигнала в този случай ще бъде по-високо, а освен това е възможно и неговото стъпаловидно усилване. Клонираните ДНК последователности (PCR продукти, геномна ДНК, белязани олигонуклеотиди и други) се използват като сонди за маркиране. Етикетирането на сондата се извършва по няколко начина. Често срещани методи са ник транслация и полимеразна верижна реакция (PCR) с белязани нуклеотиди.

Редът на процедурата

Методът In situ започва с подготвителен етап - проектиране на сондите. Размерите на сондите не трябва да са достатъчно големи, за да пречат на процеса на изследване. Твърде малките сонди също са нежелателни, тъй като не гарантират надеждни резултати. Следователно за изследване се вземат сонди с размер до 1 хил. bp. Ако сондата е двуверижна ДНК, тогава киселината се денатурира преди хибридизация. Когато се получи желаният резултат (определени участъци от хромозоми или всички хромозоми са оцветени), по-нататъшната хибридизация на ДНК сонди с повтарящи се последователности се блокира. За да направите това, към хибридизационната смес се добавят немаркирани ДНК повтарящи се молекули.

Следващият етап на изследване е подготовката на препарати от интерфазни ядра или метафазни хромозоми. Клетките се фиксират в субстрата върху стъклото, след което ДНК се денатурира. За да се намали температурата на денатурация и да се запази морфологията на ядрата и хромозомите, се извършва денатурация с добавяне на формадид. След това към материала се добавят сонди и се извършва хибридизация в продължение на няколко часа. След приключването му се извършва многоетапно промиване за отстраняване на сонди, които не са свързани с молекулите на пробата.

Съвременен метод за цитогенетичен анализ, който позволява да се определят качествените и количествените промени в хромозомите (включително транслокации и микроделеции) и се използва за диференциална диагноза на злокачествени кръвни заболявания и солидни тумори.

Руски синоними

Флуоресцентна in situ хибридизация

FISH анализ

Английски синоними

Флуоресценция на мястохибридизация

Изследователски метод

Флуоресцентна in situ хибридизация.

Какъв биоматериал може да се използва за изследване?

Тъканна проба, тъканна проба в парафинов блок.

Как правилно да се подготвим за изследване?

Не се изисква подготовка.

Обща информация за изследването

Флуоресцентна in situ хибридизация (FISH) в- situхибридизация) е един от най-модерните методи за диагностициране на хромозомни аномалии. Тя се основава на използването на ДНК сонди, маркирани с флуоресцентен етикет. ДНК сондите са специално синтезирани ДНК фрагменти, чиято последователност е комплементарна на ДНК последователността на изследваните аберантни хромозоми. Така ДНК пробите се различават по състав: различни, специфични ДНК проби се използват за определяне на различни хромозомни аномалии. ДНК сондите също се различават по размер: някои могат да бъдат насочени към цяла хромозома, други към специфичен локус.

По време на процеса на хибридизация, ако има аберантни хромозоми в тестовата проба, те се свързват с ДНК сондата, която, когато се изследва с флуоресцентен микроскоп, се определя като флуоресцентен сигнал (положителен резултат от FISH тест). При липса на аберантни хромозоми, несвързаните ДНК проби се „отмиват“ по време на реакцията, което, когато се изследва с помощта на флуоресцентен микроскоп, се определя като липса на флуоресцентен сигнал (отрицателен резултат от FISH тест). Методът дава възможност да се оцени не само наличието на флуоресцентен сигнал, но и неговата интензивност и локализация. По този начин FISH тестът е не само качествен, но и количествен метод.

FISH тестът има редица предимства пред другите цитогенетични методи. На първо място, изследването FISH може да се приложи както към метафазни, така и към интерфазни ядра, тоест към неделящи се клетки. Това е основното предимство на FISH пред класическите методи за кариотипиране (напр. оцветяване на хромозоми по Романовски-Гимза), които се прилагат само върху метафазни ядра. Това прави FISH по-точен метод за откриване на хромозомни аномалии в тъкани с ниска пролиферативна активност, включително солидни тумори.

Тъй като тестът FISH използва стабилна ДНК на интерфазни ядра, голямо разнообразие от биоматериали могат да се използват за изследвания - аспирати за аспирационна биопсия под фин ъгъл, намазки, аспирати от костен мозък, биопсични проби и, което е важно, запазени тъканни фрагменти, като хистологични блокове . Така, например, FISH тест може да бъде успешно извършен върху многократни препарати, получени от хистологичен блок на проба от биопсия на гърдата при потвърждаване на диагнозата "аденокарцином на гърдата" и необходимостта от определяне на HER2/neu статуса на тумора. Трябва да се подчертае, че към момента изследването FISH се препоръчва като потвърждаващ тест при получаване на неопределен резултат от имунохистохимичното изследване на тумора за туморен маркер HER2/neu (IHC 2+).

Друго предимство на FISH е способността му да открива микроделеции, които не се откриват чрез класическо кариотипиране или PCR. Това е от особено значение в случаите на съмнение за синдром на DiGeorge и велокардиофациален синдром.

Тестът FISH се използва широко в диференциалната диагностика на злокачествени заболявания, предимно в онкохематологията. Хромозомните аномалии в съчетание с клиничната картина и имунохистохимичните данни са в основата на класификацията, определянето на тактиката на лечение и прогнозата на лимфо- и миелопролиферативните заболявания. Класически примери са хронична миелоидна левкемия - t (9; 22), остра промиелоцитна левкемия - t (15; 17), хронична лимфоцитна левкемия - тризомия 12 и др. Що се отнася до солидни тумори, изследването FISH най-често се използва при диагностициране на рак на гърдата, пикочния мехур, дебелото черво, невробластома, ретинобластома и др.

Изследването FISH може да се използва и при пренатална и предимплантационна диагностика.

Тестът FISH често се провежда в комбинация с други методи за молекулярна и цитогенетична диагностика. Резултатът от това изследване се оценява във връзка с резултатите от допълнителни лабораторни и инструментални данни.

За какво се използва изследването?

• За диференциална диагноза на злокачествени заболявания (кръв и солидни органи).

Кога е насрочено проучването?

• Ако подозирате наличието на злокачествено заболяване на кръвта или солидни тумори, тактиката на лечение и прогнозата на които зависят от хромозомния състав на туморния клон.

Какво означават резултатите?

Положителен резултат:

• Наличието на аберантни хромозоми в тестовата проба.

Отрицателен резултат:

• Отсъствието на аберантни хромозоми в тестовата проба.

Какво може да повлияе на резултата?

• Брой аберантни хромозоми.



• Имунохистохимично изследване на клиничен материал (с помощта на 1 антитяло)
• Имунохистохимично изследване на клиничен материал (използвайки 4 или повече антитела)
• Определяне на HER2 туморен статус от FISH
• Определяне на HER2 туморен статус по CISH метод

Кой поръчва изследването?

Онколог, педиатър, акушер-гинеколог, генетик.

литература

• Уан TS, Ма ES. Молекулярна цитогенетика: незаменим инструмент за диагностика на рак. Anticancer Res. 2005 юли-август;25(4):2979-83.
• Kolialexi A, Tsangaris GT, Kitsiou S, Kanavakis E, Mavrou A. Влияние на цитогенетичните и молекулярните цитогенетични изследвания върху хематологични злокачествени заболявания. Chang Gung Med J. 2012 март-апр;35(2):96-110.
• Mühlmann M. Молекулярна цитогенетика в метафазни и интерфазни клетки за ракови и генетични изследвания, диагностика и прогноза. Приложение в тъканни срезове и клетъчни суспензии. Genet Mol Res. 2002 юни 30;1(2):117-27.