Xromosoma kasalliklari diagnostikasida in situ (FISH) floresan gibridizatsiya usuli. Floresan gibridizatsiyasi Floressensiya bilan duragaylash

• Floresan in situ gibridizatsiyasi yoki FISH usuli (fluoressensiya in situ gibridizatsiyasi - FISH) sitogenetik usul bo'lib, metafaza xromosomalarida yoki in situ interfaza yadrolarida ma'lum bir DNK ketma-ketligini aniqlash va o'rnini aniqlash uchun ishlatiladi. Bundan tashqari, FISH to'qima namunasida o'ziga xos mRNKlarni aniqlash uchun ishlatiladi. Ikkinchi holda, FISH usuli hujayralar va to'qimalarda gen ekspressiyasining fazoviy-vaqt xususiyatlarini o'rnatishga imkon beradi.

  FISH usuli preimplantatsiya, prenatal va postnatal genetik diagnostikada, onkologik kasalliklar diagnostikasida va retrospektiv biologik dozimetriyada qo'llaniladi.

Tegishli tushunchalar

Mikronukleus - sitologiyada eukaryotik hujayradagi yadroning omon qolishi uchun zarur bo'lgan to'liq genomga ega bo'lmagan qismi. Bu patologik tuzilish bo'lib, har qanday to'qimalarning hujayralarida kuzatilishi mumkin. Odatda, mikronukleuslar apoptoz paytida hujayralarning anormal bo'linishi yoki yadro parchalanishi natijasida hosil bo'ladi.

Gomologik rekombinatsiya yoki umumiy rekombinatsiya genetik rekombinatsiyaning bir turi bo'lib, unda nukleotidlar ketma-ketligi ikkita o'xshash yoki bir xil xromosomalar o'rtasida almashinadi. Bu hujayralar tomonidan ikki yoki bir zanjirli DNK shikastlanishini tiklash uchun eng keng tarqalgan usuldir. Gomologik rekombinatsiya, shuningdek, meyoz davrida turli xil gen birikmalarini yaratadi, bu irsiy o'zgaruvchanlikning yuqori darajasini ta'minlaydi, bu esa o'z navbatida populyatsiyaga yaxshiroq moslashish imkonini beradi ...

Kosmidlar (kosmidlar) - lambda fagining DNK bo'lagini o'z ichiga olgan kos-saytni o'z ichiga olgan plazmidlar. In vitro fag zarralaridagi qadoqlash tizimlari bilan birgalikda ular genlarni klonlash va genomik kutubxonalarni qurishda vektor molekulalari sifatida ishlatiladi. Kosmidlar birinchi marta 1978 yilda Kollinz va Bryuning tomonidan qurilgan. Ularning nomi ikkita atamaning qisqartmasidan kelib chiqqan: cos-section (atamaning o'zi, o'z navbatida, inglizcha biriktiruvchi uchlardan - yopishqoq uchlardan keladi) va plazmid.

Genlar ketma-ketligi haqida juda ko'p ma'lumotlar to'planganligi sababli, hozirgi vaqtda genlarning funktsiyalarini aniqlash uchun teskari genetika usullari qo'llaniladi. Tadqiqotchilar genlar ketma-ketligini manipulyatsiya qiladi, ma'lum bir genni o'zgartiradi yoki o'chiradi va bu qanday o'zgarishlarga olib kelishini tahlil qiladi. Bu teskari genetikaning yo'lidir: gendan belgi/fenotipgacha. Oldinga va teskari genetika bir-birini istisno qiladigan yondashuvlar emas, balki gen funktsiyasini o'rganishda bir-birini to'ldiradi.
(ing. transformatsiya) - bakterial hujayra tomonidan DNK molekulasining tashqi muhitdan so'rilishi jarayoni. Transformatsiyaga qodir bo'lishi uchun hujayra malakali bo'lishi kerak, ya'ni DNK molekulalari hujayra membranalari orqali unga kira olishi kerak. Transformatsiya molekulyar biologiya va genetik muhandislikda faol qo'llaniladi.

Gomologik bo'lmagan uchli qo'shilish yoki gomologik bo'lmagan uchi qo'shilish (NHEJ) DNKdagi ikki zanjirli uzilishlarni tiklash usullaridan biridir. Bu jarayon gomologik bo'lmagan deb ataladi, chunki zanjirning shikastlangan uchlari gomologik rekombinatsiya jarayonidan farqli o'laroq, gomologik shablonga ehtiyoj sezmasdan, to'g'ridan-to'g'ri ligaza bilan bog'lanadi. "Gomolog bo'lmagan qo'shilish" atamasi 1996 yilda Mur va Xaber tomonidan taklif qilingan. NHEJ gomologik rekombinatsiyaga qaraganda ancha aniqroqdir...

Kullinlar hidrofobik oqsillar oilasi bo'lib, ubiquitin ligazalari (E3) uchun iskala bo'lib xizmat qiladi. Barcha eukariotlarda kullinlar bor. Ular RING oqsillari bilan birgalikda kulin-RING ubiquitin ligazalarini (CRLs) hosil qiladi, ular juda xilma-xil bo'lib, ko'plab hujayra jarayonlarida, masalan, proteolizda (ular hujayra oqsillarining taxminan 20% ni yo'q qiladi), epigenetik tartibga solish va salitsil kislotasi vositachiligida o'simlik immuniteti.

Keyingi avlod sekvensiyasi (NGS) DNK va RNKning nukleotidlar ketma-ketligini aniqlash, uning asosiy tuzilishining rasmiy tavsifini olish usulidir. Keyingi avlod sekvensiyasi usullari (NGS) texnologiyasi genomning bir nechta bo'limlarini bir vaqtning o'zida "o'qish" imkonini beradi, bu avvalgi ketma-ketlik usullaridan asosiy farqidir. SNP polimeraza ta'siri ostida zanjir uzayishining takroriy tsikllari yoki bir nechta...

Quantiferon (ba'zan quantiferon, quantiferon testi; inglizcha QuantiFERON) - Amerikaning QIAGEN kompaniyasi tomonidan ishlab chiqarilgan sil infektsiyasi uchun ferment immunoassay diagnostik testining savdo nomi. Matn immun javob interferon gamma aniqlash uchun ELISA texnologiyasidan foydalanadi.

gibridizatsiya usuli joyida* (joyida, lat.) DNK yoki RNKning to'g'ridan-to'g'ri qo'zg'almas xromosomalar va interfaza yadrolari preparatlarida DNK / RNK zondlari bilan barqaror gibrid molekulalarni hosil qilish qobiliyatiga asoslangan. Ushbu usul yordamida siz to'g'ridan-to'g'ri hujayra, hujayra yadrosi yoki xromosomalarda deyarli har qanday DNK yoki RNK ketma-ketligining aniq joylashishini aniqlashingiz mumkin.

Gibridizatsiya uchun. joyida standart usullar bo'yicha tayyorlangan har qanday to'qimalar yoki organlar hujayralarining mos sitologik yoki gistologik preparatlari. Klinik sitogenetik laboratoriyada ekilgan periferik qon limfotsitlari, xorion epiteliya sitotrofoblast hujayralari, amniotik suyuqlikning o'stirilgan va o'stirilmagan hujayralari, abort materialidan turli to'qimalar, shuningdek, bukkal epiteliy va qon hujayralarining surtmalari qo'llaniladi.

gibridizatsiya usuli joyida radioaktiv bo'lmagan modifikatsiyalangan nukleotidlar bilan belgilangan zondlardan foydalanishga asoslangan izotopik bo'lmagan variantni ishlab chiqish tufayli amaliy sitogenetika uchun alohida ahamiyatga ega. Preparatlar bo'yicha gibridlanishning izotopik bo'lmagan variantlari (ayniqsa, lyuminestsentlar) izotopiklarga nisbatan bir qator afzalliklarga ega: mikroskopning ruxsatiga (0,1 - 0,2 mkm) teng bo'lgan yuqori aniqlik, natijalarni statistik qayta ishlashga hojat yo'q, sog'liqni saqlash tadqiqotchilari uchun tezlik va xavfsizlik

Bundan tashqari, turli xil aniqlash tizimlari yordamida aniqlangan turli xil o'zgartirilgan problarning kombinatsiyasi bir vaqtning o'zida bir hujayradagi yoki bitta metafaza plastinkasida ikki yoki undan ortiq DNK ketma-ketligining joylashishini aniqlash imkonini beradi. Va DNK zondlari sifatida ftoroxromlar bilan belgilangan takrorlanuvchi ketma-ketliklardan foydalanish protsedura vaqtini 7-9 soatgacha qisqartiradi (klassik izotop bo'lmagan gibridizatsiya ikki kun davom etadi, izotop variantlari bir haftadan bir oygacha), bu ayniqsa prenatal tashxis uchun muhimdir. Foydalanish FISH usuli sitogenetik diagnostikada strukturaviy xromosomalarning o'zgarishini aniqlash, marker xromosomalarining tabiatini aniqlash va metafaza xromosomalarida ham, interfaza yadrolarida ham xromosomalar to'plamining raqamli buzilishlarini tahlil qilish imkonini beradi.

FISH usulining printsipi

Asosiyda FISH usuli sun'iy ravishda yaratilgan DNK probi va yadro DNKsining komplementar nukleotidlar ketma-ketligi o'rtasidagi gibridlanish reaktsiyasi yotadi. DNK molekulasi ikkita spiral bilan bog'langan nukleotid zanjiridan iborat bo'lib, zanjirlar ajratilgan taqdirdagina gibridlanish mumkin. DNKning nukleotid zanjirlarini uzish uchun denaturatsiya qo'llaniladi (keyingi duragaylash uchun o'rganilayotgan namuna yadrolaridagi DNK ham, DNK probining o'zi ham denatüratsiya qilinishi kerak). Denaturatsiyadan so'ng DNK probi o'zining komplementar nukleotidlar ketma-ketligiga gibridlanadi va uni lyuminestsent mikroskop yordamida aniqlash mumkin.

Shunday qilib, o'rnatish uchun protokolning umumiy shakli BALIQ quyidagi shaklda taqdim etilishi mumkin:

1. Gistologik yoki sitologik preparatni tayyorlash.
Gistologik preparatni tayyorlash standart sxema bo'yicha amalga oshiriladi: kesish, markalash, o'tkazish, quyish, mikrotomiya, kesilgan joyni shisha slaydga qo'yish va parafinizatsiya. Sitologik preparatni tayyorlashda maxsus cho'ktiruvchi eritmalar va sentrifugalash qo'llaniladi, bu konsentrlangan hujayra suspenziyasini olish imkonini beradi.

2. Oldindan davolash (agar kerak bo'lsa).
Gibridlanishga to'sqinlik qiladigan oqsillarni yo'q qilish uchun preparat proteazlar tomonidan qayta ishlanadi.

3. Preparatga DNK probini qo'llash va undan keyingi denaturatsiya.
Zond va DNK namunasini denatüratsiya qilish uchun ular formamid bilan ishlanadi va taxminan 85-90 ° S haroratgacha qizdiriladi.

4. Gibridlanish.
Denatürasyondan so'ng preparat ma'lum bir haroratgacha sovutiladi (klinik tadqiqotlar holatida 37 ° C) va nam kamerada bir necha soat davomida inkubatsiya qilinadi (inkubatsiya davomiyligi har bir maxsus protokolda ko'rsatilgan). Hozirgi vaqtda denaturatsiya va duragaylash uchun avtomatik gibridizatorlardan foydalaniladi.

5. Yuvish.
Gibridizatsiya tugallangandan so'ng, bog'lanmagan zondlarni yuvish kerak, aks holda bu FISH natijalarini baholashni qiyinlashtiradigan fon yaratadi. Yuvish uchun odatda sitrat va natriy xlorid (SSC) o'z ichiga olgan eritma ishlatiladi.

6. Qarama-qarshi bo'yash.
Floresan bo'yoqlar (DAPI - 4,6-diamidin-2-fenilindol; propidiy yodid) yordamida barcha yadro DNKsi bo'yalgan.

7. Natijalarni lyuminestsent mikroskop yordamida tahlil qilish. Muntazam operatsiyalar (dewaxing, oldindan tozalash, yuvish) avtomatlashtirilishi mumkin.

* - Material ochiq manbalardan olingan ma'lumotlar asosida tayyorlangan.

Nuklein kislotalarning in situ gibridlanishi Usul bir zanjirli ketma-ketliklar (ribo- yoki deoksiribo-, oligo- yoki polinukleotidlar) va ularni to'ldiruvchi ketma-ketliklar asosida sun'iy ravishda yaratilgan etiketli zondlar o'rtasida ikki zanjirli duragaylarni hosil qilish imkoniyatiga asoslanadi. maqsadlar - tahlil qilingan DNK yoki RNK molekulalari. Gibridlanish joylarini aniqlash uchun DNK zondi (DNK zondi) muxbirlar guruhi bilan etiketlanadi: ü radioaktiv izotop, ü ftorxrom, ü dog 'yoki lyuminestsent mahsulot beruvchi ferment, ü belgilangan tana bog'laydigan hapten, va boshqalar.

Zondda muxbirlar guruhi mavjudligi sababli gibridni aniqlash orqali - RNKning ma'lum bir turini kodlaydigan genlar sonini taxmin qilish, - genomdagi transkripsiyalanmagan DNK ulushini aniqlash, - aniqlash mumkin. ma'lum genlarning bir-biri bilan bog'lanishi va ularning xromosomalardagi aniq joylashuvi. Molekulyar gibridizatsiya usuli yuqori sezuvchanlikka ega (yorliqli probning oz miqdori (10 -15 va 10 -19 M) va shunga mos ravishda uning maqsaddagi bir-birini to'ldiruvchi ketma-ketligini aniqlash mumkin) va tahlil tezligi, bu usulni tadqiqot uchun ham ishlatishga imkon beradi. faoliyat va tibbiyot, veterinariya va o'simlikchilikda irsiy va yuqumli kasalliklar diagnostikasi uchun.

Molekulyar sitogenetikada asosan nuklein kislotalarning in situ gibridlanishiga asoslangan yangi texnologiyalarning paydo bo'lishi xromosoma diagnostikasi imkoniyatlarini sezilarli darajada kengaytirdi.

Interfaza sitogenetikasi: 1. Ko'p rangli xromosoma tasmasi (MCB). 2. Floresan in situ gibridizatsiya (FISH). 3. FISH ning boshqa usullar bilan birikmasi: -sitologiya + FISH; -gistologiya + FISH; -immunofenotiplash + FISH (FICTION); Metafaza sitogenetikasi: 1. Xromosomalarning qattiq bo'yalishi (To'liq bo'yash). 2. Qiyosiy genomik duragaylash (CGH). 3. Rangni o'zgartirish karyotiplash (CCK). 4. Ko'p rangli karyotiplash: Spektral karyotiplash (SKY); ko'p rangli FISH (M - FISH, M - BAND).

FISH - floresan in situ gibridizatsiyasi - bu xromosomalar, mRNK va boshqalardagi o'ziga xos DNK ketma-ketliklarini aniqlash va lokalizatsiya qilish uchun ishlatiladigan sitogenetik usuldir. Texnika floresan yorliqli DNK/RNK zondini komplementar DNK/RNK ketma-ketligi bilan duragaylashga asoslangan. Yorliq floresan mikroskop yordamida aniqlanadi. FISH usuli 30 yildan ko'proq vaqt oldin kiritilgan. Xromosomalarda genlarni fizik xaritalash usuli sifatida keng tarqalgan. Keyinchalik u tadqiqotning boshqa sohalarida (klinik genetika, reproduktiv tibbiyot, toksikologiya, evolyutsion biologiya, qiyosiy va hujayra genomikasi, xromosoma biologiyasi sohalarida) qoʻllanildi. Hozirgi vaqtda FISH asosan xromosomalarning fizik va genetik xaritalarini tuzish, interfaza va metafaza xromosomalarida strukturaviy o'zgarishlarni, translokatsiyalarni, mikrodeletsiyalarni, genlarning kuchayishini aniqlash uchun ishlatiladi. Ilm-fan yutuqlari (nuklein kislotalar va xromatinning kimyoviy va fizik xususiyatlarini yaxshiroq tushunish), shuningdek, flüoresan mikroskopiya va raqamli tasvirning rivojlanishi natijasida usul doimiy ravishda takomillashtirildi (sezuvchanlik, o'ziga xoslik, aniqlik yaxshilanishi). va bu usulning ko'plab variantlari ishlab chiqilgan.

1) Hujayralar shisha slaydga tushirilib, xromosomalarning tarqalishiga olib keladi. 4) Xromosomalar DAPI yordamida qarama-qarshi bo'yaladi 2) Floresan yorliqli prob xromosomalarga joylashtiriladi va muhrlanadi. 3) Zond va xromosomalar denaturatsiya qilinadi, gibridlanadi, keyin yuviladi 5) Slayd lyuminestsent mikroskop ostida ko'riladi.

FISH ni o'rnatish protokolining umumiy shakli quyidagicha ifodalanishi mumkin: 1. Gistologik yoki sitologik namunani tayyorlash. Gistologik preparatni tayyorlash standart sxema bo'yicha amalga oshiriladi: kesish, markalash, o'tkazish, quyish, mikrotomiya, kesilgan joyni shisha slaydga qo'yish va parafinizatsiya. Sitologik preparatni tayyorlashda maxsus cho'ktiruvchi eritmalar va sentrifugalash qo'llaniladi, bu konsentrlangan hujayra suspenziyasini olish imkonini beradi. 2. Oldindan davolash (agar kerak bo'lsa). Gibridlanishga to'sqinlik qiladigan oqsillarni yo'q qilish uchun preparat proteazlar tomonidan qayta ishlanadi. 3. Preparatga DNK probini qo'llash va undan keyingi denaturatsiya. Zond va DNK namunasini denatüratsiya qilish uchun ular formamid bilan ishlanadi va taxminan 85-900 S haroratgacha qizdiriladi.

4. Gibridlanish. Denatürasyondan so'ng preparat ma'lum bir haroratgacha sovutiladi (klinik tadqiqotlarda 370 C) va nam kamerada bir necha soat davomida inkubatsiya qilinadi (inkubatsiya davomiyligi har bir maxsus protokolda ko'rsatilgan). Hozirgi vaqtda denaturatsiya va duragaylash uchun avtomatik gibridizatorlardan foydalaniladi. 5. Yuvish. Gibridizatsiya tugallangandan so'ng, bog'lanmagan zondlarni yuvish kerak, aks holda bu FISH natijalarini baholashni qiyinlashtiradigan fon yaratadi. Yuvish uchun odatda sitrat va natriy xlorid (SSC) o'z ichiga olgan eritma ishlatiladi. 6. Qarama-qarshi bo'yash. Floresan bo'yoqlar (DAPI - 4, 6-diamidin-2 fenilindol; propidiy yodid) yordamida barcha yadro DNKsi bo'yalgan. 7. Floresan mikroskop yordamida natijalarni tahlil qilish Muntazam operatsiyalar (deparafinizatsiya, dastlabki ishlov berish, yuvish) avtomatlashtirilishi mumkin.

Floresan mikroskop yordamida telomerik hududlarni tekshirish. Interfaza (yadro) va metafaza (individual xromosomalar) bosqichida olingan tasvirlar birlashtiriladi. ko'k rang - DAPI.

FISH-usulining afzalliklari: 1. Interfaza yadrolarida genetik materialni o'rganish imkoniyati; 2. Ha/yo‘q asosida ob’ektiv natijalarni olish miqdoriy usul 3. Natijalarni nisbatan sodda talqin qilish; yuqori aniqlik.FISH usulining kamchiliklari: 1. Flüoresan bo‘yoqlar tez “so‘nadi”; mikroskop.

FISH usuli cheklangan o'lchamdagi nukleotidlar ketma-ketligi bo'lgan maxsus texnologiyalar yordamida yaratilgan DNK zondi va o'rganilayotgan sitogenetik preparatning yadro DNKsining to'ldiruvchi qismi o'rtasidagi gibridlanish reaktsiyasiga asoslangan. DNK probi FISH ni o'rnatish uchun asosiy element bo'lib, "yorliq" ga ega, ya'ni ftoroxromni tashuvchi antikorlar tomonidan keyingi vizualizatsiya uchun ftorxrom yoki hapten bilan bevosita bog'langan nukleotidlarni o'z ichiga oladi. Bog'lanmagan etiketli DNK yuviladi va keyin gibridlangan DNK probi floresan mikroskop yordamida aniqlanadi.

DNK belgilari to'g'ridan-to'g'ri va bilvosita bo'linadi. To'g'ridan-to'g'ri yorliqlash DNKga muxbir elementlarini kiritadi - ftoroxromlar (rodamin, dietilaminokumarin, Texas qizil va boshqalar). Bilvosita markalash usuli - DNK namunasi oraliq ligandlar (biotin, dioksigenin, 2, 4-dinitrofenol) bilan oldindan konjugatsiya qilinadi, ularning mavjudligi sitologik preparatda keyinchalik ftoroxromlar yordamida aniqlanadi. Bunday holda, usulning sezgirligi sezilarli darajada oshadi, chunki ligand floroxrom bilan o'zaro ta'sir qilishning bir nechta joylarini o'z ichiga olishi mumkin. 32 P-belgili zond bilan in situ gibridizatsiya birinchi marta 1969 yilda tasvirlangan. DNK zondlarini yorliqlash va aniqlash uchun radioaktiv bo'lmagan tizimlarning rivojlanishi in situ gibridizatsiya usulini xavfsiz, bajarilishi oson va natijalarni qayta ishlashda kamroq mehnat talab qiladigan qildi. Floresan bo'yoqlari yumshoq va ulardan foydalanish oson, cheksiz saqlanishi mumkin, yuqori aniqlik beradi va bir vaqtning o'zida bir nechta DNK ketma-ketligini tekshirishga imkon beradi.

Problar: bir zanjirli/ikki zanjirli DNK/RNK asosiy/ikkilamchi yorliqli problar. Problar quyidagi belgilar bilan belgilanadi: 1) to'g'ridan-to'g'ri: ftorxrom biriktirilgan nukleotidlarni kiritish orqali (PCR yoki nik tarjimasi) 2) lyuminestsent bilan belgilangan antikorlar biriktirilgan reportyor molekula (masalan: digoksigenin, biotin) orqali. Signalni kuchaytirish uchun siz floresan yorlig'i bilan belgilangan ikkilamchi, uchinchi darajali va hokazo antikorlardan foydalanishingiz mumkin. DNase nicks DNK Nick Translation DNK polimeraza I 3' gidroksil DNK polimeraza I ga yangi nukleotidlar qo'shadi Xromosoma ko'rish: DAPI yordamida (2 mg/ml). 4', 6-diamidino-2-fenilindol; AT ga boy DNK hududlariga kuchli bog'lanish; UV nurlari bilan qo'zg'alish; emissiya 461 nm (ko'k).

Hozirgi vaqtda zamonaviy molekulyar sitogenetikada keng qo'llaniladigan bir nechta asosiy yondashuvlar mavjud: kengaytirilgan xromosoma hududlari va butun xromosomalar materialini aniqlash. Muayyan DNK ketma-ketligini qiziqtiradigan mintaqada aniqlash. Alohida xromosoma mintaqalarining nomutanosibligini tahlil qilish. Kengaytirilgan xromosoma mintaqalari va butun xromosomalar materialini aniqlash uchun xromosomaga xos va mintaqaga xos DNK problari ("bo'yash zondlari") keng qo'llaniladi.

Har xil turdagi zondlarning xarakteristikalari 1. Lokusga xos zondlar (LSI - lokus - xromosomalarning ma'lum hududlari bilan bog'laydigan o'ziga xos identifikatorlar.) Bu zondlar ajratilgan DNK ning mavjud qisqa (takrorlanmaydigan) ketma-ketligini aniqlash uchun ishlatiladi, ular ishlatiladi. yorliqli zondni tayyorlash va uni keyinchalik xromosomalar to'plami bilan gibridizatsiya qilish. Ular turli patologik sharoitlarda (alohida xromosomalar uchun monosomiya va trisomiya) diagnostik va prognostik ahamiyatga ega xromosoma aberratsiyasini aniqlash uchun mo'ljallangan. Ushbu namunalardan eng keng tarqalgan foydalanish prenatal sitogenetik diagnostikada, ayniqsa xorionik to'qimalar hujayralari va amniotsitlarning interfaza yadrolarini o'rganishda qo'llanilgan.

2. Xromosomalarning telomerik hududlariga DNK problari (TEL telomerik prob) xromosoma qo'llarining terminal hududlariga ta'sir qiluvchi o'chirish va qayta joylashishni aniqlash uchun mo'ljallangan. Bunday zondlar xromosomalarning p- yoki q-qo'llari uchun xos bo'lib, taxminan 300 kb uzunlikdagi hududni to'ldiradi. xromosomaning oxiridan boshlab. Qoida tariqasida, xromosomalarning qisqa va uzun qo'llari uchun DNK zondlari turli xil ftoroxromlar bilan bog'liq bo'lib, bu bitta sitogenetik preparatda xromosomaning ikkala telomerik mintaqasini aniqlash imkonini beradi.

3. sentromera takroriy zondlar, alfa yoki xromosoma hisoblagichlari (CEP - centromere. Enumeration. Probe) tandem alfa va beta yo'ldosh takrorlanishlari ketma-ketligi bilan ifodalangan xromosomaga xos DNK zondlaridir. Bu takrorlanishlar asosan xromosomalarning sentromerik yoki perisentromerik geterokromatin hududlarida joylashgan. Ularning yordami bilan har bir xromosoma boshqa rangga bo'yalgan bo'lishi mumkin, bu sizga xromosomalar sonini va ularning normal sonidan og'ishlarini tezda aniqlash imkonini beradi, xromosomaning alohida bo'limlarini to'ldiradi, lekin umuman butun uzunligini qamrab oladi. Bunday zondlar kutubxonasidan foydalanib, butun xromosomani "bo'yash" va individning differentsial spektral karyotipini olish mumkin. Ushbu turdagi tahlil xromosoma aberatsiyasini, masalan, bir xromosomaning bir qismi boshqasining yelkasiga o'tkazilganda translokatsiyalarni tahlil qilish uchun ishlatiladi.

Ilovalar FISH quyidagi klinik diagnostik vazifalarni hal qilish uchun keng qo'llaniladi: 1. Prenatal periimplantatsiya va xromosoma anomaliyalarining diagnostikasi. In vitro urug'lantirish (IVF) klinikalari va perinatal markazlarda qo'llaniladi. O'z vaqtida (IVF holatida embrionni implantatsiya qilishdan oldin yoki homila rivojlanishining dastlabki bosqichlarida) tug'ilmagan bolada genetik kasalliklarni aniqlash va zarur choralarni ko'rish imkonini beradi. 2. Onkogematologiya. Onkogematologik kasalliklar turli xil xromosoma aberatsiyalari natijasida yuzaga keladi, shuning uchun ularni tashxislash uchun tegishli CEP va LSI problari qo'llaniladi. 3. Qattiq o'smalarning diagnostikasi. Hozirgi vaqtda o'ziga xos saraton rivojlanishi va genomdagi o'ziga xos o'zgarishlar o'rtasida tobora ko'proq sabab-oqibat aloqalari o'rnatilmoqda. Shuning uchun tegishli DNK problaridan foydalanganda onkologik FISH diagnostikasini o'tkazish mumkin.

Interfaza sitogenetikasi: FISH ning boshqa usullar bilan kombinatsiyasi: - FISH immunofenotiplash (FICTION); + FICTION (Fluoressensiyali immunofenotiplash va interfaza sitogenetikasi neoplazmalarni tekshirish vositasi sifatida) - o'simta hujayralarini o'rganish uchun. Ushbu tahlil uchun qon, suyak iligi yoki boshqa to'qimalarning preparatlarining bo'yalmagan surtmalari qo'llaniladi. 1-bosqich - preparatlar o'ziga xos monoklonal antikorlar bilan inkubatsiya qilinadi, 2-bosqich - antigen-monoklonal antikor kompleksini keyingi vizualizatsiya qilish uchun ftoroforlar bilan konjugatsiya amalga oshiriladi. 3-bosqich - DNK zondlari bilan in situ gibridizatsiyani amalga oshirish. Monoklonal antikorlarni va DNK problarini aniqlash uchun rangda farq qiluvchi floroforlar qo'llaniladi. Preparatni kerakli filtrlar to'plamiga ega floresan mikroskop ostida o'rganish bir vaqtning o'zida gibridlanishning immunofenotipini va interfaza yadrolaridagi signallarni tahlil qilish imkonini beradi.

C da TNFAIP 3 ning xromosomadeletsiyasi. HL interfaza sitogenetikasi bilan aniqlanadi. ning fantastik tahlillari. vakili c. HL holatlari birlashtirilgan. CD 30 ifodasi (qizil) va TNFAIP 3 va xromosoma 6 sentromera uchun FISH problari (ko'k [b]). A–C va E va F dagi ikki rangli tahlillarda TNFAIP 3 probi yashil rang bilan belgilangan (g); D da qo'llaniladigan uch rangli tahlilda TNFAIP 3 probi g/to'q sariq rangli kolokalizatsiyalangan (ko) signal beradi. Ikki xil strategiya CD 30 immunofluoresans bilan birgalikda ikki va uch rangli FISH tahlillarini ko'rsatish uchun ishlatiladi; i. e. , ikki rangli tahlillar (A–C va E va F) uch rangli displey yordamida ko'rsatiladi, Isis dasturi tomonidan olingan soxta ko'p rangli displey esa bir vaqtning o'zida to'rtta rangni ko'rsatish uchun uch rangli tahlil (D) uchun qo'llaniladi ( ya'ni, CD 30 [r], TNFAIP 3 [g] va apelsin va xromosoma 6 sentromera [b]).

Mikrotasvirlarni raqamli yozib olish nafaqat ftoroforlarning kombinatsiyasini, balki ularning nisbatlarini, intensivligini psevdoranglarga aylantirish imkoniyatini ochdi.

Xromosomalarni ko'p rangli bo'yash (Muli. Color Banding - MSV) Bu usul barcha xromosomalarni to'liq tahlil qilish uchun emas, balki bitta xromosomani batafsil tahlil qilish uchun mo'ljallangan. Lokusga xos DNK problari turli ftoroforlar yoki ftoroforlarning kombinatsiyasi bilan etiketlanadi, shuning uchun har bir DNK zondlarining signal darajasi intensivlikda o'zgaradi. DNK zond signallarining bir-biriga mos keladigan intensivlik profillari xromosoma bo'ylab turli flüoroforlarning floresans intensivligi nisbatlarining o'zgarishini ta'minlaydi. Intensivlik nisbatlarini psevdokolorlarga tarjima qilish mumkin, shuning uchun tasvirning har bir nuqtasi va shuning uchun xromosomalarning har biri o'ziga xos psevdocolorga ega bo'ladi. Ko'p rangli FISH usulining ushbu versiyasi onkologik kasalliklarda nafaqat xromosomalararo, balki intraxromosoma ichidagi o'zgarishlarni tahlil qilishda yuqori samarali bo'lib chiqdi. Biroq, uni muvaffaqiyatli qo'llash uchun birinchi navbatda tekshiriladigan xromosomani aniqlash kerak. Molekulyar sitogenetikaning ushbu usuli ma'lum xromosomalar bilan bog'liq bo'lgan karyotip buzilishlarini tahlil qilish uchun javob beradi.

Bugungi kunga kelib, 5-xromosomadagi barcha inson xromosomalari uchun MCVni ta'minlaydigan DNK zondlari to'plamlari yaratilgan; 5-xromosomaning ko'p rangli bandi; 5-xromosomaning idiogrammasi; MSV uchun ishlatiladigan ftoroxromlar).

Tarixiy jihatdan interfaza sitogenetikasiga qaraganda erta paydo bo'lgan metafaza sitogenetikasi xromosoma kasalliklarining keng doirasini aniqlashga imkon beradi, ammo buning uchun o'rganilayotgan hujayralar meiozning metafaza bosqichida bo'lishi kerak.

Ko'p rangli karyotiplash Tahlil qo'llarni yoki butun xromosomalarni (WCP problari - butun xromosoma bo'yog'i) doimiy bo'yash DNK problari yordamida amalga oshiriladi. Bunday zondlar xromosomaning butun uzunligi bo'ylab joylashgan ko'plab qisqa DNK ketma-ketliklari bilan gibridlanadi. Shunday qilib, lyuminestsent mikroskop ostida qaralganda, xromosoma ma'lum bir rangda bir xil bo'yalgan ko'rinadi.

Ushbu tahlil uchun ishlatiladigan DNK zondlari inson xromosomalarining to'liq to'plami uchun qattiq bo'yash zondlari aralashmasidan iborat bo'lib, ular bir nechta ftoroxromlarning kombinatsiyasi bilan belgilanadi, ularning nisbati har bir xromosoma juftligi uchun alohida tanlanadi. Tasvirning har bir nuqtasi uchun barcha ftorxromlarning lyuminesans intensivligini baholaydigan tasvirni tahlil qilish uchun tegishli ro'yxatga olish usullari va kompyuter dasturlaridan foydalanish har bir xromosoma juftligi o'ziga xos "psevdokolor" ga ega bo'lgan karyotiplashni amalga oshirishga imkon beradi. ".

M-FISH (koʻp maqsadli koʻp rangli koʻp rangli yoki multipleks. FISH) ftorxromga xos filtr toʻplamlaridan foydalangan holda anʼanaviy koʻp rangli FISHning umumiy nomidir. M-FISH printsipi barcha ishlatiladigan ftoroxromlarning signalini alohida raqamli qayd etishdan iborat bo'lib, bu filtr to'plamlarini ketma-ket o'zgartirish orqali erishiladi. Barcha tasvirlar alohida fayllarga yozib olinadi, bu ularni signal va fonni ajratish, shuningdek signal miqdorini aniqlash bilan bog'liq holda samarali qayta ishlashni amalga oshirish imkonini beradi. Barcha qayd etilgan ma'lumotlarni maxsus dasturiy ta'minot yordamida qayta ishlash tasvirning har bir nuqtasida ftorxrom signallari darajasi haqidagi ma'lumotlarni psevdoranglarga aylantiradi. Amaldagi DNK problari sonining asosiy cheklovlaridan biri qo'zg'alish va emissiya spektrlari bir-biriga mos kelmaydigan mavjud ftoroxromlar soni va tegishli filtr to'plamlarining mavjudligi.

24 rangli FISH Eng ko'p qo'llaniladigan M-FISH - barcha inson xromosomalaridan materialni bir vaqtning o'zida aniqlash uchun 24 rangli FISH. U xromosoma translokatsiyasini aniqlashda yuqori samaradorlikka ega, lekin oʻchirish va inversiyalarni aniqlash uchun moʻljallanmagan. Biroq, bu muammoni xromosomalarni DAPI bilan bir vaqtda bo'yash orqali qisman hal qilish mumkin, bu esa xromosoma moddasi allaqachon aniqlangan xromosomalarning differentsial chizig'ini tahlil qilish imkonini beradi. Afsuski, shuni ta'kidlash kerakki, M-FISHdan keyin xromosoma DAPI tasmasi sifati an'anaviy in situ gibridizatsiyadan keyin GTG differentsial binoni va hatto DAPI tasmasidan sezilarli darajada past.

Rx. FISH M-FISH printsipi inson xromosomalari uchun ko'p rangli shtrix kodni va turlararo in situ gibridizatsiyasiga asoslangan ko'p rangli xromosoma bandlash usulini yaratish uchun ishlatilgan. 24 rangli FISHdan farqli o'laroq, bu usul intraxromosomalarning qayta tuzilishining bir qismini to'g'ridan-to'g'ri aniqlash imkonini beradi. Rx da ishlatiladigan DNK problari. FISH 3 ta ftoroxrom birikmasi bilan belgilangan, bu 7 ta psevdo rang beradi. Ular xromosomalarning alohida hududlarini bo'yab, ularning rang chizig'ini yaratadilar. Rx uchun DNK namunalarining bu xususiyati. FISH ularni olish usuli bilan belgilanadi. Ular ikkita gibbon turining xromosomaga xos DNK kutubxonalari: Hylobates concolor va Hylobates syndactylus.

Zamonaviy gibbon turlarining shakllanishi jarayonida sodir bo'lgan intensiv xromosomalarning qayta tuzilishi natijasida, xromosomalari konservatizmi bilan mashhur bo'lgan odamlarda xromosomalarning tashkil etilishi bilan solishtirganda, ularning xromosomalari moddasi juda aralashgan. Odamning 1-xromosomasining gibbon xromosomalariga nisbati 1-rasmda koʻrsatilgan.

2-rasmda Rx natijasida olingan inson xromosomalarining umumiy ko'rinishi ko'rsatilgan. BALIQ. a) Metafaza plastinkasi b) Xromosomalarning joylashishi.

Biroq, RXFISH jiddiy cheklovlarga ega - bitta rangli RX diapazoni ichida sodir bo'lgan xromosomalarni qayta tashkil etish, agar ular ushbu diapazon o'lchamida sezilarli va oson ko'rinadigan o'zgarishlarga olib kelmasa, bu usul yordamida aniqlanmaydi. - zondlar turli xromosomalarning bir nechta xromosoma mintaqalarini bitta psevdokolorda bo'yashadi. Biroq, ishlatiladigan ftorxromlar soni ortib borayotganligi sababli, RXFISH usuli, shubhasiz, odatiy 24 rangli FISHga qaraganda ko'proq ma'lumotga ega bo'ladi.

Hozirgi vaqtda RXFISH ning afzalliklari quyidagi fikrlarni o'z ichiga oladi: Usul bitta ko'p rangli FISH tajribasida butun inson genomini tahlil qilish imkonini beradi. Savdoda sotiladigan etiketli DNK problari va kerakli aniqlash tizimlari mavjud. Usul ichki va xromosomalararo o'zgarishlarning muhim qismini tezda aniqlash imkonini beradi. "Rang bandi" ning metafaza xromosomalarini avtomatik aniqlash mumkin. Har bir inson xromosomasi o'ziga xos rangli shtrix kodga ega. RXFISH Cyto ish stantsiyasiga birlashtirilgan. Vizyon va standart floresan mikroskopiya tizimlari.

Spektral karyotiplash (SKY-spektralkaryotiplash) Spektral karyotiplashda tasvirni mikroskopik tahlil qilishning asosiy tamoyillari M-FISH da qo'llaniladiganlar bilan deyarli bir xil. Farqlar tasvirni ro'yxatdan o'tkazish usuli bilan bog'liq. SKY texnologiyasi epifluoresans yoki an'anaviy yorug'lik mikroskopiyasi bilan bog'liq bo'lishidan qat'i nazar, bitta o'lchov davomida tasvirning barcha nuqtalari uchun spektral egri chiziqlarni olish imkonini beradi. Insonning barcha xromosomalarini spektral karyotiplash uchun beshta ftoroxrom ishlatiladi, biri yashil spektrda, ikkitasi qizil va ikkitasi infraqizil rangda. DNK zondlarini markalashda ishlatiladigan barcha ftoroxromlarning qo'zg'alishi va emissiyasi bitta filtrlar to'plamida sodir bo'ladi, bu ularning ketma-ket o'zgarishi, oraliq fokuslanishi va natijada tasvirning fazoviy siljishi, chegara qiymatlarini aniqlash kabi muammolardan qochish imkonini beradi. va segmentatsiya maskalari. Spektral egri chiziqlarni tahlil qilish asosida ma'lum bir nuqtada o'ziga xos ftoroxromlarning mavjudligi yoki yo'qligi aniqlanadi.

Keyingi bosqich - bu tahlil qilinadigan materialning xromosomaga tegishliligini to'g'ridan-to'g'ri va aniq aniqlash imkonini beruvchi tasniflash tartibi. Bu marker xromosoma moddasining ishonchli identifikatsiyasini (xromosomagacha) ta'minlaydi, shuningdek, turli xil o'zgarishlar natijasida paydo bo'lgan xromosoma hosilalari. SKY ning katta afzalligi shundaki, DAPI rang berish spektral tasvirga parallel ravishda qayd etilgan. DAPI bandining dasturiy ta'minotini takomillashtirish GTG bandiga yaqin sifatda differentsial chiziqqa erishish imkonini beradi. Spektral tasvirni parallel tahlil qilish va xromosomalarni sifatli differentsial bo'yash imkoniyati SKY natijalarini talqin qilishni sezilarli darajada osonlashtiradi va xromosomalarning uzilish nuqtalarini aniqroq aniqlash imkonini beradi. SKY ning shubhasiz afzalliklari orasida qo'zg'alish va emissiya spektrlari bir-biriga mos keladigan ftoroxromlardan foydalanish imkoniyati kiradi, bu foydalanish mumkin bo'lgan ftoroxromlar ro'yxatini sezilarli darajada kengaytiradi, shuningdek, bir vaqtning o'zida ishlatilishi mumkin bo'lgan ftorxromlar sonini oshiradi. Yangi ftoroxromning ro'yxati yangi filtrlar to'plamini sotib olishni talab qilmaydi, chunki SKY uchun spektral FISH va DAPI uchun bitta filtr birligi etarli.

SKY ning kamchiliklariga quyidagilar kiradi: - mikroskopik tasvirlarni yozib olish uchun zarur bo'lgan uzoq ta'sir qilish vaqti. - Nisbatan kichik DNK zondlari bilan tadqiq qilishda SKY M-FISHdan bir oz kamroq samarador.

Rangni o'zgartiruvchi karyotiplash (CCKs Rangni o'zgartiruvchi karyotiplash) Bu usul ftoroxromlar bilan bog'langan DNK zondlari va antikorlarni tashuvchi DNK zondlari bilan gibridlangan DNK namunalari orasidagi signal uzunligidagi farqni tahlil qilishga asoslangan. Usul faqat 3 ta filtr yordamida amalga oshiriladi va maxsus kameralar va dasturlarni talab qilmaydi. Xromosomalarni aniqlash uchun bitta gibridizatsiya amalga oshiriladi va ikkita tasvir olinadi. Usul floresan signalining uzunligidagi farqga asoslanadi, chunki antikorlar bilan bog'langan DNK namunalarining ta'sir qilish vaqti ftorxromlar bilan bog'liq bo'lgan namunalarga qaraganda 80-90% kamroq. Gibridizatsiya reaktsiyasidan so'ng, tamponlar tegishli birlamchi antikorlarga ta'sir qiladi va keyin birinchi tasvirni olish uchun ingl. Keyin slaydlar ikkilamchi antikorlar va bir xil ftoroxromlar bilan bog'langan avidinga ta'sir qiladi. DAPI yordamida zarbalarga qarshi bo'yash mumkin.

Kelajakda yana 3 ta filtr yordamida preparatlarning tasvirlari olinadi. Ushbu tasvirlar maxsus dastur yordamida taqqoslanadi va ikkinchi rasm olinadi, unda faqat ma'lum antikorlar bilan bog'langan xromosomalar ko'rinadi. Shunday qilib, ba'zi xromosomalar faqat birinchi yoki ikkinchi tasvirda floresan bo'ladi, boshqalari esa turli xil tasvirlarda rangni o'zgartiradi.

Qiyosiy genomik duragaylash (CGH) Usul genomdagi miqdoriy buzilishlarni aniqlash uchun yaratilgan. U DNK zond sifatida butun genomdan foydalangan holda in situ gibridizatsiya reaktsiyasini o'tkazishga asoslangan. Izolyatsiya qilingan va normal donor DNKsi turli rangdagi ftoroxromlar bilan belgilanadi, shuning uchun ularni DNK zondlariga aylantiradi. Ushbu zondlarning ekvivalent miqdori aralashtiriladi va nazorat sitogenetik preparati bilan duragaylashda ishlatiladi. FISHdan so'ng, metafazalar lyuminestsent mikroskopda tahlil qilinadi va har bir xromosomaning butun uzunligi bo'ylab ikkita ftoroxromning floresans intensivligini aniqlash uchun maxsus kompyuter tasvirini tahlil qilish dasturidan foydalaniladi.

Sinov namunasining karyotipida miqdoriy o'zgarishlar bo'lmasa, ikkita ftoroxromning lyuminesans intensivligining ma'lum nisbati kuzatiladi. Gen kuchaytirilganda, tegishli ftoroxrom signalining intensivligi oshadi va genetik materialning bir qismi yo'qolganda, aksincha, zaiflashadi. Shunday qilib, CGH genomik nomutanosiblikni aniqlash imkonini beradi, ammo bu usulni muvozanatli translokatsiyalar va inversiyalarni aniqlash uchun qo'llash mumkin emas va trisomiyalar va o'chirishlar faqat muvozanatsiz hududning o'lchami kamida 10 million tayanch juft bo'lsa, aniqlanishi mumkin.

Sinov namunasidagi xromosoma muvozanati floresan nisbatini (FR) hisoblash yo'li bilan ikki xil ftoroxromning floresans intensivligidagi farqdan baholanadi.

CGH usuli genom o'zgarishlarini tahlil qilishning boshqa usullariga nisbatan bir qator afzalliklarga ega: Birinchidan, u sinov materialining manbasiga bog'liq emas va DNKning kichik miqdori, shu jumladan arxiv materiallari bilan muvaffaqiyatli bajarilishi mumkin. Ikkinchidan, bu bitta tajribada genom bo'ylab genetik materialning nusxalari sonining yo'qolishi yoki ko'payishi haqida batafsil ma'lumot olish imkonini beradi. Uchinchidan, CGH usuli o'rganilayotgan to'qimadan metafaza xromosomalari preparatlarini tayyorlashni talab qilmaydi, ya'ni hujayra madaniyati jarayoniga va tegishli artefaktlarga bog'liq emas.

Genomik situ gibridizatsiya (genomisin situ gibridizatsiyasi, GISH) - bu situ gibridizatsiya usulining bir varianti bo'lib, u fiksatsiyalangan namunalar bilan duragaylash uchun bir turdagi organizmning umumiy genomik DNKsi floresan yorliqli zond sifatida ishlatiladi. boshqa turdagi organizmlarning umumiy genomik DNKsi raqobatlashadigan; genomlardagi turlararo va turlararo farqlarni, xromosomalarni qayta tuzish, oʻchirish va almashtirishlarni aniqlash uchun foydalaniladi.

BALIQ oʻzgarishlari 1) Q-FISH – miqdoriy BALIQ: Lansdorp va boshqalar tomonidan ishlab chiqilgan: U. M. Martens, J. M. Zijlmans, S. S. Poon, V. Dragowska, J. Yui, E. A. Chaves, R. K. Vard va P. M. Lansdorp. 1998. Inson xromosomasida qisqa telomerlar 17 p. Nat. Genet. 18:76-80. miqdoriy usul. Oqim sitometriyasi bilan ishlash uchun mo'ljallangan. Dastlab telomerik takrorlanishlar sonini hisoblash orqali xromosoma uzunligini o'lchash uchun foydalanilgan (ravshanligi: 200 bp). PNA-konjugatsiyalangan problar ishlatiladi. Dastlab, metafaza xromosomalari (QFISH to'g'ri) o'rganilgan, endi bu usul interfaza xromosomalari (IQ-FISH) uchun ham qo'llaniladi. Q-FISH hujayra madaniyatida, to'qima bo'limlarida (ikkalasi ham ko'zoynakda) amalga oshiriladi. Hozirgi vaqtda Q-FISH telomerlarning qarish va saraton shakllanishi jarayonlaridagi rolini o'rganishda muhim vositadir.

PNA-FISH - peptid nuklein kislotalari FISH: Peptid nuklein kislotalari (PNA) DNKning sintetik analoglari bo'lib, ularda azotli asosni qo'llab-quvvatlovchi dezoksiriboza fosfatning shakar asosi zaryadsiz peptid magistral bilan almashtiriladi. Ushbu tuzilish natijasida: PNA-oligomerik zond komplementar DNK/RNK bilan gibridlashganda elektrostatik repulsiya sodir bo'lmaydi. PNA-DNK (PNA-RNK) duplekslari tabiiy gomo/heteroduplekslarga qaraganda ancha barqaror. PNA-DNK bilan bog'lanishning yuqori o'ziga xosligi: PNA-DNK gibridizatsiyasi DNK-DNK gibridlanishiga qaraganda tayanch juftlik mos kelmasligiga ancha sezgir. Shunday qilib, PNA probi yordamida faqat bitta tayanch juftlikda farq qiluvchi ikkita sentromerik takrorlanishni ajratish mumkin. PNA nisbiy hidrofobiklikka ega (DNKga nisbatan), buning natijasida PNK hujayra devorlari orqali yaxshiroq tarqaladi => mikrobiologiyada keng qo'llaniladi. Yuqori bog'lanish o'ziga xosligi asosida: PNA texnologiyasi tez orada in situ gibridizatsiyasi uchun allelga xos zondlarni yaratish uchun asos bo'ladi, deb ishoniladi. U genetika, sitogenetika, epigenetika, mikrobiologiya va boshqalarda qo'llaniladi.

3) Flow-FISH - oqim sitometriyasi uchun FISH: 1998 yilda taklif qilingan: Rufer, N., Dragowska, W., Thornbury, G., Roosnek, E. & Lansdorp, PM. Inson limfotsitlari subpopulyatsiyalarida oqim cytometriyasi bilan o'lchanadigan telomer uzunligi dinamikasi . tabiat biotexnologiyasi. 16, 743–747 (1998). Signalni tahlil qilish (o'lchash) va saralash imkonini beruvchi Q-FISH va oqim sitometriyasining kombinatsiyasi. Oqim-FISH uchun hujayra suspenziyasi (xromosoma telomerlarining uzunligini o'lchash uchun), xromosoma tarqalishi va ajratilgan xromosomalar (keyingi xaritalash uchun) ishlatiladi. Q-FISH da bo'lgani kabi, PNA yorlig'i bo'lgan telomerik zondlar qo'llaniladi (masalan, telomerik takrorlanishlarni tasvirlash va uzunligini o'lchash uchun).Asosiy afzallik - tezroq usul (ko'p sonli hujayralarni/xromosomalarni tahlil qilish/saralash). U turli muammolarni o'rganish uchun keng qo'llaniladi: qarish, telomerlarning saqlanishi, gematopoetik ildiz hujayralari suspenziyalarini ex vivo o'rganish, bakteriyalarni o'rganish.

Ko'p parametrli tahlil bitta namunadagi hujayra turlarini farqlash, ichki nazorat qilish va leykotsitlar subtiplarini tahlil qilish imkonini beradi.

Flow-FISH ning afzalliklari: Osonlik bilan takrorlanadigan natijalar Jismoniy immunofluoressensiya va markerlardan foydalangan holda populyatsiyadagi hujayralar kichik guruhlarini tahlil qilish qobiliyati Q-FISHga qaraganda yaxshiroq ishlash Minglab hujayralarning floresansini aniqlash qobiliyati.

IZOLALANGAN XROMOSOMALARNI OQIM SITOMETRIYA YO'LI BO'LGAN TAQDIM ETISHI 1. Oqim sitometriyasi bo'yicha xromosomalarni saralash - Oqim sitometriyasi bo'yicha karyotiplash keyingi genlarni xaritalash va xromosomalar kutubxonalarini qurish uchun ishlatiladi. Saralangan xromosomalarda genlarni aniqlash va lokalizatsiya qilish keyinchalik FISH usullari / PRINS usuli (in situ markirovkasi) yoki uning o'zgarishlari va xromosomaga xos PCR yordamida amalga oshiriladi. – 2011-yilga kelib, hozirgacha 17 turdagi madaniy o‘simliklarning xromosomalari muvaffaqiyatli saralangan. - yuqori bo'linish indeksiga ega bo'lgan metafaza yoki paxitenik xromosomalarni saralash.

Floresan yorlig'i: - Xromosomalar nuklein kislotaga xos ftorxromlar bilan etiketlanadi. - Ftoroxromlar 1) azotli asoslarga xoslik, 2) eksperimental shartlarga (shu jumladan mavjud lazerlarning to'lqin uzunliklarini hisobga olgan holda) muvofiq tanlanadi. 1. Monovariant tahlil qilish uchun AT yoki GC bug'lariga xos bo'lmagan bo'yoqlardan foydalaning: propidiy yodid (qo'zg'alish cho'qqisi: 535 nm, emissiya: 617 nm, lazer kerak: 488 nm argon lazeri yoki chiroq + uzoq o'tish filtri) etidium bromidi ( qo'zg'alish cho'qqilari: : 300 va 520 nm, emissiya: 600 nm, talab qilinadigan lazer: 488 nm argon lazeri yoki chiroq + uzoq o'tish filtri) Bu teglar A, G, T yoki azotli asoslar tarkibidan qat'i nazar, DNKni bo'yaydi. 2. Ikki o'zgaruvchan tahlildan foydalanish uchun: xromomitsin (G-C tayanch juftlari uchun xos), A 3 qo'zg'alish cho'qqisi: 458 nm, emissiya 580 nm. Lazer: , 458 nm minimal 400 m. V quvvat. Hoechst 33258 (AT-T bp uchun xos), qo'zg'alish: 351-364 nm, emissiya: 470 nm. Lazer: 351 -364 nm (kuchli). Ftorxrom spektrlarining qisman bir-biriga mos kelishi sababli lazerlarni vaqt va makonda ajratish kerak.

2. Saralashdan so'ng xromosomalar/nukleotidlar ketma-ketligini o'rganish (fizik va genetik xaritalar tuzish uchun va hokazo) FISH BAC-FISH PRINS C-PRINS Uzun xromosomali yirik genomlarni o'rganish. Ko'p sonli takroriy ketma-ketliklarni xaritalash (masalan: telomerik va sentromerik hududlar). Qisqa problardan foydalanish. Ko'p sonli takrorlashlar tufayli signal kuchli. Standart zond hajmi: 15 - 30 nukleotid. BALIQ

BALIQ muammolari: bitta lokusli DNK ketma-ketligini (ya'ni, takrorlanmaydigan noyob DNK ketma-ketligini) lokalizatsiya qilish qiyin, chunki standart qisqa problardan foydalanganda signal juda zaif bo'ladi. Signalni kuchaytirish uchun zond uzunligini bir necha kilobazagacha oshirish sezgirlikning pasayishiga va => o'ziga xos bo'lmagan bog'lanishga olib keladi. Yechim: BAC-FISH -BAC-FISH FISH usuli va bakterial sun'iy xromosomalarga (BAC) o'rnatilgan genomik DNK klonlaridan foydalanishning kombinatsiyasi bo'lib, katta DNK ketma-ketliklarini kiritish imkonini beradi. - kichik genomli organizmlarning alohida xromosomalarini aniqlash va xaritalashning samarali usuli. Zond sifatida BAC problari, overgolar (bir-biriga yopishgan oligonukleotidlar) ishlatiladi.

FISHga muqobil: PRINS PRINS (in situ markirovkasi) oligonukleotid DNK primerini denaturatsiyalangan xromosoma DNKsining gomologik ketma-ketligi bilan tavlash va keyinchalik belgilangan nukleotidlar bilan in situ primerni fermentativ kengaytirish orqali xromosomalarni belgilash usulidir. Birinchi marta Koch va boshqalar tomonidan tasvirlangan. 1989 yilda (Koch, JE, Kølvraa, S., Petersen, KB, Gregersen, N. va Bolund, I. (1989) in situ alfa sun'iy yo'ldosh DNK ning xromosomaga xos yorliqlash uchun oligonükleotid-priming usullari. Xromosoma 959, -265). PRINS FISHga muqobildir. U nukleotidlar ketma-ketligini lokalizatsiya qilish, metafaza yoki interfaza xromosomalari yoki xromosoma juftlarini (jumladan, xromosoma anevloidiyasini) aniqlash va hisoblash uchun ishlatiladi. yorliqsiz primerni (primer-primer) qiziqtiruvchi DNK bilan tavlanishi; termostabil DNK polimeraza va belgilangan nukleotidlar yordamida primerning cho'zilishi; reaksiyaning tugashi (bloklovchi molekulaning 3'-uchiga biriktirilishi) Primer : PCR cheklash fragmenti; - bilvosita (biotin/dig ftoroxrom-konjugatsiyalangan avidin/ anti-dig) - Har bir PRINS reaktsiyasi natijalarida faqat bir juft homolog xromosoma (bitta xromosoma) aniqlanishi mumkin. Xuddi shu slayddagi keyingi PRINS reaktsiyasi faqat avvalgisini bloklagandan keyin amalga oshirilishi mumkin. - Ko'p sonli takroriy DNK ketma-ketligi uchun ishlatiladi.

PRINS ning afzalliklari: 1. Oligonukleotid primerini sintez qilish uchun zarur bo'lgan minimal ketma-ketlik ma'lumotlarini talab qiladi. 2. Xromosomaga qiziqish ketma-ketligini aniqlashning eng tez va eng oddiy usuli (juda uzoq vaqt davomida gibridlangan og'ir FISH zondlaridan foydalanish bilan solishtirganda). 3. Probni markalash bosqichini istisno qilish. 4. Qisqa noyob ketma-ketliklarni aniqlashda c-PRINS signalini kuchaytirish uchun etiketli nukleotidlar bilan primerni uzaytirish qobiliyati. Kam nusxali takrorlash yoki qisqa noyob ketma-ketliklarni aniqlash uchun yanada sezgir usul qo'llaniladi - PRINS (c-PRINS) velosiped. C-PRINS Gosden va boshqalar tomonidan taklif qilingan. 1991 yilda Kubalakova va boshqalar tomonidan takomillashtirilgan keng tarqalgan protokol. , 2001 (Kubaláková M, Vrána J, Cíhalíková J, Lysák MA, Dole J (2001). PRINS va C-PRINS yordamida o'simlik xromosomalarida DNK ketma-ketligini lokalizatsiya qilish. Hujayra fanida usullar 23: 71-82). C-PRINS PCR ga o'xshash bir qator termal davrlarni o'z ichiga oladi.

FISH uchun qobiq suyuqligi: -BD Bioscience Standard (GM Baerlocher, I Vulto, G de Jong, PM Lansdorp. Telomerlarning o'rtacha uzunligini o'lchash uchun oqim sitometriyasi va FISH (FISH oqimi). 2006. Tabiat protokollari 1, - 2365 – 2376) -40 m. M KCl + 10 m. M Na. Cl (Vrána J, Kubaláková M, Simková H, Cíhalíkova J, Lysák MA, Dolezel J. Oddiy bug'doyda mitotik xromosomalarning oqimli saralanishi (Triticum aestivum L.). Genetika. 2000; 156 (4): 2033-41) -M . Shunday qilib, dithiothreitol holda 4 bufer (Lj. Li, L. Ma, K. Arumuganathan, YC Song. Flow-tartiblangan xromosomalar: o'simlik genini jismoniy xaritalash uchun nozik material. Caryologia. 2006, jild 59, № 2: 99 -103 ) -avtoklavlangan 0,1% (wt/vol) Na. Cl-50m. M Na. Cl (M Kubaláková, P Kovářová, P Suchánkova, J Číhalíkova, J Bartoš, S Lucretti, N Vatanabe, SF Kianian, J Doležel. Tetraploid bug'doyda xromosomalarni saralash va uning genom tahlili uchun potentsiali. Genetika. 2220, Genetika): 823–829) -Xromosomani barqarorlashtiruvchi poliamin buferi (oqsil o'z ichiga olgan qobiq suyuqligi) (Darzynkiewics Z, Robinson JP, Crissman H. Flow Cytometry, 2nd Ed. Part B. San-Diego, CA. Academic Press, Inc. 1994)

Standart mikroskoplar hujayralarni molekulyar darajada tekshirishga imkon bermaydi. Bu erda faqat kuchli o'sish etarli emas. Raqamli tasvir, qo'shimcha reagentlar va boshqa materiallar va asboblar talab qilinadi. DNK va RNKni tahlil qilish uchun hozirda In situ gibridizatsiya deb ataladigan usul qo'llaniladi. Namunalarni bo'yash va radiatsiya tahlilini o'z ichiga olganligi sababli, u floresan gibridizatsiya yoki FISH deb ham ataladi.

Floresan in situ gibridizatsiyasi genetik tadqiqotlar, saraton diagnostikasi, homiladorlikni boshqarish va fanning boshqa ko'plab sohalarida keng qo'llaniladi. Usul, nomidan ko'rinib turibdiki, DNK va RNK molekulalarining zondlar bilan barqaror bog'lanish, ya'ni gibrid molekulalarni hosil qilish xususiyatiga asoslangan. "In situ" so'zlari barcha kuzatishlar "in situ", ya'ni bevosita qo'shimcha vositadan foydalanmasdan amalga oshirilishini anglatadi.

DNK problari (zondlar) sinov namunasidagi molekulalarni to'ldiruvchidir. Ular ftoroforlar (molekulaga flüoresanlik xususiyatini beruvchi moddalar) bilan belgilangan nukleozidlarni o'z ichiga oladi. Bu usul to'g'ridan-to'g'ri markalash deb ataladi; agar gibrid konjugat molekulalari marker sifatida ishlatilsa, bilvosita etiketka olinadi. To'g'ridan-to'g'ri yorliqlash bilan, gibridizatsiya tugagandan so'ng darhol floresan mikroskop ostida kuzatilishi mumkin. Bilvosita yorliqlash uchun boshqa binoni jarayoni amalga oshiriladi. U konjugat molekulalarini o'rganilgan namunalardan rangi bo'yicha ajratadi.

Bilvosita etiketka bilan gibridizatsiya usuli ko'proq vaqt va reagentlarni talab qiladi, ammo bu sizga yanada ishonchli natijalarga erishish imkonini beradi. Bu holda signal darajasi yuqoriroq bo'ladi va qo'shimcha ravishda uning bosqichma-bosqich kuchaytirilishi ham mumkin. Klonlangan DNK ketma-ketliklari (PCR mahsulotlari, genomik DNK, etiketli oligonükleotidlar va boshqalar) etiketkalash problari sifatida ishlatiladi. Prob markalash bir necha usul bilan amalga oshiriladi. Keng tarqalgan usullar nik translatsiyasi va etiketli nukleotidlar bilan polimeraza zanjiri reaktsiyasi (PCR).

Jarayonning tartibi

In situ usuli tayyorgarlik bosqichidan boshlanadi - problarni loyihalash. Problarning o'lchamlari tadqiqot jarayoniga xalaqit beradigan darajada katta bo'lmasligi kerak. Juda kichik problar ham istalmagan, chunki ular ishonchli natijalarni kafolatlamaydi. Shuning uchun tadqiqot uchun 1 ming bp gacha bo'lgan zondlar olinadi. Agar zond ikki zanjirli DNK bo'lsa, unda gibridlanishdan oldin kislota denatüratsiya qilinadi. Istalgan natijaga erishilganda (xromosomalarning ma'lum hududlari yoki barcha xromosomalar bo'yalgan), takroriy ketma-ketliklar bilan DNK problarining keyingi gibridlanishi bloklanadi. Buning uchun duragaylash aralashmasiga etiketlanmagan DNK takroriy molekulalar qo'shiladi.

Tadqiqotning keyingi bosqichi interfaza yadrolari yoki metafaza xromosomalarining preparatlarini tayyorlashdir. Hujayralar shisha ustidagi substratda o'rnatiladi, shundan so'ng DNK denatüratsiya qilinadi. Denaturatsiya haroratini pasaytirish va yadrolar va xromosomalarning morfologiyasini saqlab qolish uchun denaturatsiya formadid qo'shilishi bilan amalga oshiriladi. Shundan so'ng, problar materialga qo'shiladi va hibridizatsiya bir necha soat davomida amalga oshiriladi. Tugatgandan so'ng, namuna molekulalari bilan bog'lanmagan zondlarni olib tashlash uchun ko'p bosqichli yuvish amalga oshiriladi.

Xromosomalardagi sifat va miqdoriy o'zgarishlarni (shu jumladan translokatsiyalar va mikrodeletsiyalarni) aniqlashga imkon beruvchi zamonaviy sitogenetik tahlil usuli va xavfli qon kasalliklari va qattiq o'smalarning differentsial diagnostikasi uchun qo'llaniladi.

Rus tilidagi sinonimlar

Floresan in situ gibridizatsiyasi

BALIQ tahlili

Inglizcha sinonimlar

Floresans joyida gibridlanish

Tadqiqot usuli

Floresan in situ gibridizatsiyasi.

Tadqiqot uchun qanday biomaterialdan foydalanish mumkin?

To'qima namunasi, kerosin blokidagi to'qimalar namunasi.

Tadqiqotga qanday to'g'ri tayyorgarlik ko'rish kerak?

Tayyorgarlik talab qilinmaydi.

Tadqiqot haqida umumiy ma'lumot

Floresan in situ gibridizatsiyasi (FISH) ichida- situ gibridizatsiya) xromosoma anomaliyalarini tashxislashning eng zamonaviy usullaridan biridir. U lyuminestsent yorliq bilan belgilangan DNK problaridan foydalanishga asoslangan. DNK problari maxsus sintez qilingan DNK bo'laklari bo'lib, ularning ketma-ketligi o'rganilayotgan aberrant xromosomalarning DNK ketma-ketligini to'ldiradi. Shunday qilib, DNK namunalari tarkibida farqlanadi: turli xil, o'ziga xos DNK namunalari turli xromosoma anomaliyalarini aniqlash uchun ishlatiladi. DNK zondlari ham hajmi jihatidan farq qiladi: ba'zilari butun xromosomaga, boshqalari esa ma'lum bir joylashuvga yo'naltirilishi mumkin.

Gibridlanish jarayonida tekshirilayotgan namunada aberrant xromosomalar mavjud bo‘lsa, ular DNK zondi bilan bog‘lanadi, u floresan mikroskop bilan tekshirilganda lyuminestsent signal sifatida aniqlanadi (FISH testining ijobiy natijasi). Aberrant xromosomalar bo'lmasa, bog'lanmagan DNK namunalari reaksiya davomida "yuviladi", floresan mikroskop yordamida tekshirilganda, floresan signalning yo'qligi (FISH testining salbiy natijasi) sifatida aniqlanadi. Usul nafaqat floresan signalning mavjudligini, balki uning intensivligi va lokalizatsiyasini ham baholashga imkon beradi. Shunday qilib, FISH testi nafaqat sifat, balki miqdoriy usul hamdir.

FISH testi boshqa sitogenetik usullarga nisbatan bir qator afzalliklarga ega. Avvalo, FISH tadqiqoti metafaza va interfaza yadrolariga, ya'ni bo'linmaydigan hujayralarga nisbatan qo'llanilishi mumkin. Bu faqat metafaza yadrolari uchun qo'llaniladigan klassik karyotiplash usullaridan (masalan, Romanovskiy-Giemsa xromosomalarini bo'yash) FISHning asosiy ustunligidir. Bu FISH ni proliferativ faolligi past bo'lgan to'qimalarda, shu jumladan qattiq o'smalarda xromosoma anomaliyalarini aniqlashning aniqroq usuliga aylantiradi.

FISH testi interfaza yadrolarining barqaror DNKsidan foydalanganligi sababli, tadqiqot uchun turli xil biomateriallardan foydalanish mumkin - nozik burchakli aspiratsion biopsiya aspiratlari, smearlar, suyak iligi aspiratlari, biopsiya namunalari va eng muhimi, gistologik bloklar kabi saqlanib qolgan to'qimalar bo'laklari. Shunday qilib, masalan, "ko'krak adenokarsinomasi" tashxisini va o'simtaning HER2/neu holatini aniqlash zaruriyatini tasdiqlashda ko'krak biopsiyasi namunasining gistologik blokidan olingan takroriy preparatlarda FISH testi muvaffaqiyatli o'tkazilishi mumkin. Shuni ta'kidlash kerakki, hozirgi vaqtda FISH tadqiqoti HER2 / neu (IHC 2+) o'simta belgisi uchun o'simtani immunohistokimyoviy o'rganishning noaniq natijasini olishda tasdiqlovchi test sifatida tavsiya etiladi.

FISH ning yana bir afzalligi uning klassik karyotiplash yoki PCR bilan aniqlanmagan mikrodeletsiyalarni aniqlash qobiliyatidir. Bu DiGeorge sindromi va velokardiyofasial sindromga shubha qilingan hollarda alohida ahamiyatga ega.

FISH testi malign kasalliklarning differentsial diagnostikasida, birinchi navbatda, onkogematologiyada keng qo'llaniladi. Xromosoma anomaliyalari klinik ko'rinish va immunohistokimyoviy ma'lumotlar bilan birgalikda limfo- va mieloproliferativ kasalliklarni tasniflash, davolash taktikasini aniqlash va prognoz qilish uchun asosdir. Klassik misollar surunkali miyeloid leykemiya - t (9; 22), o'tkir promiyelotsitar leykemiya - t (15; 17), surunkali limfotsitar leykemiya - trisomiya 12 va boshqalar. Qattiq o'smalarga kelsak, FISH tadqiqoti ko'pincha ko'krak, siydik pufagi, yo'g'on ichak, neyroblastoma, retinoblastoma va boshqalar saratonini tashxislashda qo'llaniladi.

FISH tadqiqotidan prenatal va preimplantatsiya diagnostikasida ham foydalanish mumkin.

FISH testi ko'pincha molekulyar va sitogenetik diagnostikaning boshqa usullari bilan birgalikda amalga oshiriladi. Ushbu tadqiqot natijasi qo'shimcha laboratoriya va instrumental ma'lumotlarning natijalari bilan birgalikda baholanadi.

Tadqiqot nima uchun ishlatiladi?

• Xatarli kasalliklar (qon va qattiq organlar) differensial diagnostikasi uchun.

O'qish qachon rejalashtirilgan?

• Agar siz malign qon kasalligi yoki qattiq o'smalar mavjudligiga shubha qilsangiz, davolash taktikasi va prognozi o'simta klonining xromosoma tarkibiga bog'liq.

Natijalar nimani anglatadi?

Ijobiy natija:

• Sinov namunasida aberrant xromosomalarning mavjudligi.

Salbiy natija:

• Sinov namunasida aberrant xromosomalarning yo'qligi.

Natijaga nima ta'sir qilishi mumkin?

• Aberrant xromosomalar soni.



• Klinik materialni immunogistokimyoviy o'rganish (1 antikor yordamida)
• Klinik materialni immunohistokimyoviy o'rganish (4 yoki undan ortiq antikorlardan foydalangan holda)
• FISH tomonidan HER2 o'simta holatini aniqlash
• CISH usuli bilan HER2 o'simta holatini aniqlash

O'qishni kim buyuradi?

Onkolog, pediatr, akusher-ginekolog, genetik.

Adabiyot

• Wan TS, Ma ES. Molekulyar sitogenetika: saraton tashxisi uchun ajralmas vosita. Antikanser Res. 2005 yil iyul-avgust;25(4):2979-83.
• Kolialexi A, Tsangaris GT, Kitsiou S, Kanavakis E, Mavrou A. Sitogenetik va molekulyar sitogenetik tadqiqotlarning gematologik malign o'smalarga ta'siri. Chang Gung Med J. 2012 yil mart-aprel;35(2):96-110.
• Mühlmann M. Saraton va genetik tadqiqotlar, diagnostika va prognoz uchun metafaza va interfaza hujayralarida molekulyar sitogenetik. To'qima bo'limlarida va hujayra suspenziyalarida qo'llanilishi. Genet Mol Res. 2002 yil 30-iyun;1(2):117-27.