Methode der Fluoreszenz-Hybridisierung in situ (FISH) bei der Diagnose von Chromosomenerkrankungen. Fluoreszenzhybridisierung Fluoreszenzhybridisierung

• Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung oder das FISH-Verfahren (Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung - FISH) ist ein zytogenetisches Verfahren, das verwendet wird, um die Position einer spezifischen DNA-Sequenz auf Metaphase-Chromosomen oder in Interphase-Kernen in situ nachzuweisen und zu bestimmen. Darüber hinaus wird FISH verwendet, um spezifische mRNAs in einer Gewebeprobe nachzuweisen. Im letzteren Fall ermöglicht die FISH-Methode die Feststellung raumzeitlicher Merkmale der Genexpression in Zellen und Geweben.

  Die FISH-Methode wird in der Präimplantations-, Prä- und Postnatal-Gendiagnostik, in der Diagnostik onkologischer Erkrankungen, in der retrospektiven biologischen Dosimetrie eingesetzt.

Verwandte konzepte

Mikronukleus - in der Zytologie ein Fragment des Zellkerns in einer eukaryotischen Zelle, das nicht das vollständige Genom enthält, das für sein Überleben notwendig ist. Es ist eine pathologische Struktur und kann in den Zellen jedes Gewebes beobachtet werden. Typischerweise werden Mikrokerne als Ergebnis einer abnormalen Zellteilung oder Kernfragmentierung während der Apoptose gebildet.

Die homologe Rekombination oder allgemeine Rekombination ist eine Art der genetischen Rekombination, bei der Nukleotidsequenzen zwischen zwei ähnlichen oder identischen Chromosomen ausgetauscht werden. Dies ist die von Zellen am häufigsten verwendete Methode, um doppel- oder einzelsträngige DNA-Schäden zu reparieren. Die homologe Rekombination erzeugt während der Meiose auch eine Vielzahl von Genkombinationen, die ein hohes Maß an erblicher Variabilität bieten, was wiederum der Bevölkerung ermöglicht, sich besser anzupassen ...

Cosmide (Cosmide) – Plasmide, die ein DNA-Fragment des Lambda-Phagen enthalten, einschließlich der cos-Stelle. Zusammen mit Verpackungssystemen in Phagenpartikeln in vitro werden sie als Vektormoleküle für die Klonierung von Genen und beim Aufbau genomischer Bibliotheken verwendet. Cosmide wurden erstmals 1978 von Collins und Brüning konstruiert. Ihr Name kommt von einer Abkürzung zweier Begriffe: Cosektion (der Begriff selbst wiederum kommt von den englischen kohäsiven Enden - klebrige Enden) und Plasmid.

Aufgrund der Anhäufung einer riesigen Menge an Informationen über Gensequenzen werden derzeit häufig Methoden der reversen Genetik verwendet, um die Funktionen von Genen zu identifizieren. Forscher manipulieren Gensequenzen, verändern oder schalten ein bestimmtes Gen aus und analysieren, zu welchen Veränderungen dies führt. Dies ist der Weg der reversen Genetik: vom Gen zum Merkmal/Phänotyp. Vorwärts- und Rückwärtsgenetik schließen sich nicht gegenseitig aus, sondern ergänzen sich bei der Untersuchung der Genfunktion.
(eng. Transformation) - der Prozess der Aufnahme eines DNA-Moleküls aus der äußeren Umgebung durch eine Bakterienzelle. Um zur Transformation fähig zu sein, muss eine Zelle kompetent sein, das heißt, DNA-Moleküle müssen in der Lage sein, durch die Zellmembranen in sie einzudringen. Transformation wird aktiv in der Molekularbiologie und Gentechnik eingesetzt.

Nicht-homologe Endverknüpfung oder nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) ist eine der Möglichkeiten, Doppelstrangbrüche in DNA zu reparieren. Dieser Prozess wird als nicht-homologe bezeichnet, da die beschädigten Enden der Kette im Gegensatz zum Prozess der homologen Rekombination direkt durch eine Ligase verbunden werden, ohne dass eine homologe Matrize erforderlich ist. Der Begriff "nicht-homologe Endverbindung" wurde 1996 von Moore und Haber vorgeschlagen. NHEJ ist deutlich ungenauer als die homologe Rekombination ...

Cullins sind eine Familie hydrophober Proteine, die als Gerüst für Ubiquitin-Ligasen dienen (E3). Alle Eukaryoten scheinen Cullins zu haben. Sie bilden in Kombination mit RING-Proteinen Culin-RING-Ubiquitin-Ligasen (CRLs), die sehr vielfältig sind und bei vielen zellulären Prozessen eine Rolle spielen, beispielsweise bei der Proteolyse (sie zerstören etwa 20 % der zellulären Proteine), der epigenetischen Regulation und Pflanzenimmunität, vermittelt durch Salicylsäure.

Die Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) ist eine Technik zur Bestimmung der Nukleotidsequenz von DNA und RNA, um eine formale Beschreibung ihrer Primärstruktur zu erhalten. Die Technologie der Next-Generation-Sequencing-Methoden (NGS) ermöglicht es Ihnen, mehrere Abschnitte des Genoms auf einmal zu „lesen“, was den Hauptunterschied zu früheren Sequenzierungsmethoden darstellt. SNP wird unter Verwendung wiederholter Zyklen von Polymerase-induzierter Kettenverlängerung oder mehrerer ...

Quantiferon (manchmal Quantiferon, Quantiferon-Test; englisch QuantiFERON) ist der Handelsname für einen Enzymimmunoassay-Diagnosetest für Tuberkulose-Infektionen, hergestellt von der amerikanischen Firma QIAGEN. Der Text verwendet die ELISA-Technologie, um Interferon-Gamma der Immunantwort nachzuweisen.

Hybridisierungsmethode vor Ort* (an Ort, lat.) basiert auf der Fähigkeit von DNA oder RNA, stabile Hybridmoleküle mit DNA/RNA-Sonden direkt auf Präparaten von fixierten Chromosomen und Interphasekernen zu bilden. Mit dieser Methode lässt sich die genaue Lage fast jeder DNA- oder RNA-Sequenz direkt in der Zelle, im Zellkern oder in den Chromosomen bestimmen.

Zur Hybridisierung. vor Ort geeignete zytologische oder histologische Präparate von Zellen beliebiger Gewebe oder Organe, hergestellt nach Standardverfahren. In einem klinischen zytogenetischen Labor werden Präparate von kultivierten peripheren Blutlymphozyten, chorionischen epithelialen Zytotrophoblastenzellen, kultivierten und unkultivierten Fruchtwasserzellen, verschiedenen Geweben aus Abtreibungsmaterial sowie Abstrichen von Wangenepithel und Blutzellen verwendet.

Hybridisierungsmethode vor Ort ist von besonderer Bedeutung für die praktische Zytogenetik aufgrund der Entwicklung einer nicht-isotopischen Variante basierend auf der Verwendung von Sonden, die mit nicht-radioaktiv modifizierten Nukleotiden markiert sind. Nicht-isotopische Varianten der Hybridisierung auf Präparaten (insbesondere fluoreszierende) haben eine Reihe von Vorteilen gegenüber isotopischen: hohe Auflösung, die der Auflösung eines Mikroskops entspricht (0,1 - 0,2 μm), keine Notwendigkeit einer statistischen Verarbeitung der Ergebnisse, Geschwindigkeit und Sicherheit für Gesundheitsforscher

Darüber hinaus ermöglicht die Kombination unterschiedlich modifizierter Sonden, die mit unterschiedlichen Nachweissystemen nachgewiesen werden, die gleichzeitige Bestimmung der Lage von zwei oder mehr DNA-Sequenzen in einer Zelle oder auf einer Metaphaseplatte. Und die Verwendung von repetitiven Sequenzen, die mit Fluorochrome als DNA-Sonden markiert sind, reduziert die Verfahrensdauer auf 7–9 Stunden (klassische Nicht-Isotopen-Hybridisierung dauert zwei Tage, Isotopenvarianten von einer Woche bis zu einem Monat), was besonders für die pränatale Diagnostik wichtig ist. Verwendungszweck FISH-Methode In der zytogenetischen Diagnostik ermöglicht es die Identifizierung struktureller chromosomaler Umlagerungen, die Feststellung der Natur von Markerchromosomen und die Analyse von numerischen Verletzungen des Chromosomensatzes, sowohl auf Metaphase-Chromosomen als auch in Interphase-Kernen.

Prinzip der FISH-Methode

Im Kern FISH-Methode liegt die Hybridisierungsreaktion zwischen einer künstlich erzeugten DNA-Sonde und ihrer komplementären Nukleotidsequenz der Kern-DNA. Das DNA-Molekül besteht aus zwei helikalen Nukleotidketten, und eine Hybridisierung ist nur möglich, wenn sich die Ketten trennen. Um die Nukleotidketten der DNA zu trennen, wird eine Denaturierung verwendet (für die anschließende Hybridisierung müssen sowohl die DNA in den Kernen der zu untersuchenden Probe als auch die DNA-Sonde selbst denaturiert werden). Nach der Denaturierung hybridisiert die DNA-Sonde mit ihrer komplementären Nukleotidsequenz und kann unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops nachgewiesen werden.

So ist die allgemeine Form des Protokolls für die Einstellung FISCH kann in folgender Form dargestellt werden:

1. Herstellung eines histologischen oder zytologischen Präparats.
Die Vorbereitung eines histologischen Präparats erfolgt nach dem Standardschema: Schneiden, Markieren, Verdrahten, Gießen, Mikrotomie, Auflegen des Schnitts auf einen Objektträger und Entparaffinierung. Bei der Herstellung eines zytologischen Präparats werden spezielle Präzipitationslösungen und Zentrifugation verwendet, wodurch eine konzentrierte Zellsuspension erhalten werden kann.

2. Vorbehandlung (falls erforderlich).
Das Präparat wird von Proteasen verarbeitet, um das Vorhandensein von Proteinen zu eliminieren, die die Hybridisierung behindern.

3. Aufbringen einer DNA-Sonde auf das Präparat und anschließende Denaturierung.
Um die Sonde und Proben-DNA zu denaturieren, werden sie mit Formamid behandelt und auf eine Temperatur von etwa 85–90°C erhitzt.

4. Hybridisierung.
Nach der Denaturierung wird das Medikament auf eine bestimmte Temperatur (37 °C im Falle klinischer Studien) abgekühlt und mehrere Stunden in einer feuchten Kammer inkubiert (die Dauer der Inkubation ist in jedem spezifischen Protokoll angegeben). Gegenwärtig werden automatische Hybridisierer zur Denaturierung und Hybridisierung verwendet.

5. Waschen.
Sobald die Hybridisierung abgeschlossen ist, müssen ungebundene Sonden ausgewaschen werden, was sonst einen Hintergrund erzeugen würde, der die Auswertung von FISH-Ergebnissen erschwert. Zum Spülen wird üblicherweise eine Lösung verwendet, die Citrat und Natriumchlorid (SSC) enthält.

6. Gegenfärbung.
Mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffen (DAPI - 4,6-Diamidin-2-Phenylindol; Propidiumiodid) wird die gesamte Kern-DNA angefärbt.

7. Analyse der Ergebnisse unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops. Routinevorgänge (Entwachsen, Vorbehandlung, Waschen) können automatisiert werden.

* - Das Material wurde auf der Grundlage von Informationen aus offenen Quellen erstellt.

In-situ-Hybridisierung von Nukleinsäuren Das Verfahren beruht auf der Möglichkeit, doppelsträngige Hybride zwischen künstlich erzeugten markierten Sonden auf der Basis einzelsträngiger Sequenzen (Ribo- oder Desoxyribo-, Oligo- oder Polynukleotid) und dazu komplementärer Sequenzen zu bilden Ziele - analysierte DNA- oder RNA-Moleküle. Zur Identifizierung von Hybridisierungsstellen wird eine DNA-Sonde (DNA-Sonde) mit einer Reportergruppe markiert: ü ein radioaktives Isotop, ü ein Fluorochrom, ü ein Enzym, das einen Farbstoff oder ein lumineszierendes Produkt liefert, ü ein Hapten, an das der markierte Körper bindet, usw.

Durch den Nachweis eines Hybrids aufgrund des Vorhandenseins einer Reportergruppe in der Sonde ist es möglich, - die Anzahl der Gene abzuschätzen, die einen bestimmten RNA-Typ codieren, - den Anteil nicht transkribierter DNA im Genom zu bestimmen, - festzustellen die Verknüpfung bestimmter Gene untereinander - und ihre genaue Lage auf Chromosomen. Das Mhat eine hohe Empfindlichkeit (eine kleine Menge an markierter Sonde (10 –15 und 10 –19 M) und dementsprechend seine komplementäre Sequenz im Ziel kann nachgewiesen werden) und Analysegeschwindigkeit, was die Verwendung dieses Verfahrens sowohl für die Forschung ermöglicht Tätigkeiten und zur Diagnose von Erb- und Infektionskrankheiten in Medizin, Veterinärmedizin und Pflanzenbau.

Das Aufkommen neuer Technologien in der molekularen Zytogenetik, die hauptsächlich auf der in situ-Hybridisierung von Nukleinsäuren basieren, hat die Möglichkeiten der Chromosomendiagnostik erheblich erweitert.

Interphase-Zytogenetik: 1. Mehrfarbige Chromosomenbandierung (MCB). 2. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH). 3. Kombination von FISH mit anderen Methoden: -Zytologie + FISH; -Histologie + FISCH; -Immunphänotypisierung + FISH (FICTION); Metaphase-Zytogenetik: 1. Solide Färbung von Chromosomen (Ganze Malerei). 2. Vergleichende genomische Hybridisierung (CGH). 3. Farbwechsel-Karyotypisierung (CCK). 4. Mehrfarbige Karyotypisierung: Spektrale Karyotypisierung (SKY); mehrfarbiger FISCH (M - FISCH, M - BAND).

FISH - Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung - ist eine zytogenetische Methode zum Nachweis und zur Lokalisierung spezifischer DNA-Sequenzen auf Chromosomen, mRNA usw. Die Technik basiert auf der Hybridisierung einer fluoreszenzmarkierten DNA/RNA-Sonde mit einer komplementären DNA/RNA-Sequenz. Die Markierung wird unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops nachgewiesen. Die FISH-Methode wurde vor über 30 Jahren eingeführt. Es ist als Methode zur physikalischen Kartierung von Genen auf Chromosomen weit verbreitet. Später wurde es auf andere Forschungsgebiete angewendet (in den Bereichen klinische Genetik, Reproduktionsmedizin, Toxikologie, Evolutionsbiologie, vergleichende und zelluläre Genomik und Chromosomenbiologie). Im Moment wird FISH hauptsächlich verwendet, um physikalische und genetische Karten von Chromosomen zu erstellen, um strukturelle Umlagerungen, Translokationen, Mikrodeletionen, Genamplifikationen in Interphase- und Metaphase-Chromosomen zu erkennen. Aufgrund der Fortschritte in der Wissenschaft (besseres Verständnis der chemischen und physikalischen Eigenschaften von Nukleinsäuren und Chromatin) sowie der Entwicklung der Fluoreszenzmikroskopie und der digitalen Bildgebung wurde die Methode ständig verbessert (Verbesserungen in Sensitivität, Spezifität, Auflösung) und viele Variationen dieser Methode wurden entwickelt.

1) Zellen werden auf einen Glasobjektträger getropft, wodurch sich Chromosomen ausbreiten. 4) Chromosomen werden mit DAPI gegengefärbt. 2) Eine fluoreszenzmarkierte Sonde wird auf Chromosomen platziert und versiegelt. 3) Die Sonde und die Chromosomen werden denaturiert, hybridisiert und dann gewaschen. 5) Der Objektträger wird unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet

Die allgemeine Form des Protokolls zum Einrichten von FISH kann wie folgt dargestellt werden: 1. Herstellung eines histologischen oder zytologischen Präparats. Die Vorbereitung eines histologischen Präparats erfolgt nach dem Standardschema: Schneiden, Markieren, Verdrahten, Gießen, Mikrotomie, Auflegen des Schnitts auf einen Objektträger und Entparaffinierung. Bei der Herstellung eines zytologischen Präparats werden spezielle Präzipitationslösungen und Zentrifugation verwendet, wodurch eine konzentrierte Zellsuspension erhalten werden kann. 2. Vorbehandlung (falls erforderlich). Das Präparat wird von Proteasen verarbeitet, um das Vorhandensein von Proteinen zu eliminieren, die die Hybridisierung behindern. 3. Aufbringen einer DNA-Sonde auf das Präparat und anschließende Denaturierung. Um die Sonde und Proben-DNA zu denaturieren, werden sie mit Formamid behandelt und auf eine Temperatur von etwa 85-900 C erhitzt.

4. Hybridisierung. Nach der Denaturierung wird das Medikament auf eine bestimmte Temperatur (370 °C bei klinischen Studien) abgekühlt und mehrere Stunden in einer feuchten Kammer inkubiert (die Dauer der Inkubation ist in jedem spezifischen Protokoll angegeben). Gegenwärtig werden automatische Hybridisierer zur Denaturierung und Hybridisierung verwendet. 5. Waschen. Sobald die Hybridisierung abgeschlossen ist, müssen ungebundene Sonden ausgewaschen werden, was sonst einen Hintergrund erzeugen würde, der die Auswertung von FISH-Ergebnissen erschwert. Zum Spülen wird üblicherweise eine Lösung verwendet, die Citrat und Natriumchlorid (SSC) enthält. 6. Gegenfärbung. Mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffen (DAPI - 4, 6-Diamidin-2-Phenylindol; Propidiumiodid) wird die gesamte Kern-DNA gefärbt. 7. Analyse der Ergebnisse mit einem Fluoreszenzmikroskop Routineoperationen (Entparaffinierung, Vorbehandlung, Waschen) können automatisiert werden.

Untersuchung von Telomerregionen mit einem Fluoreszenzmikroskop. Die im Stadium der Interphase (Kern) und Metaphase (einzelne Chromosomen) erhaltenen Bilder werden kombiniert. blaue Farbe - DAPI.

Vorteile der FISH-Methode: 1. Möglichkeit, genetisches Material in Interphasekernen zu untersuchen; 2. Das Erhalten objektiver Ergebnisse auf Ja/Nein-Basis ist eine quantitative Methode 3. Relativ einfache Interpretation der Ergebnisse Hohe Auflösung Nachteile der FISH-Methode: 1. Fluoreszenzfarbstoffe „verblassen“ schnell Mikroskop.

Die FISH-Methode basiert auf der Hybridisierungsreaktion zwischen einer mit speziellen Technologien hergestellten DNA-Sonde, bei der es sich um eine Nukleotidsequenz begrenzter Größe handelt, und einem komplementären Abschnitt der Kern-DNA des untersuchten zytogenetischen Präparats. Die DNA-Sonde ist das Hauptelement für den Aufbau von FISH und trägt eine "Markierung", d. h. sie enthält Nukleotide, die direkt mit einem Fluorochrom oder einem Hapten zur weiteren Visualisierung durch Antikörper, die ein Fluorochrom tragen, verknüpft sind. Ungebundene markierte DNA wird ausgewaschen und anschließend wird die hybridisierte DNA-Sonde unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops nachgewiesen.

Die DNA-Markierung wird in direkte und indirekte unterteilt. Die direkte Markierung führt Reporterelemente in die DNA ein – Fluorochrome (Rhodamin, Diethylaminocumarin, Texasrot usw.). Indirektes Markierungsverfahren – eine DNA-Probe wird mit Zwischenliganden (Biotin, Dioxygenin, 2,4-Dinitrophenol) vorkonjugiert, deren Vorhandensein auf einem zytologischen Präparat dann unter Verwendung von Fluorochrome nachgewiesen wird. In diesem Fall erhöht sich die Empfindlichkeit des Verfahrens stark, da der Ligand mehrere Wechselwirkungsstellen mit dem Fluorochrom enthalten kann. Die In-situ-Hybridisierung mit einer 32 P-markierten Sonde wurde erstmals 1969 beschrieben. Die Entwicklung von nicht-radioaktiven Systemen zum Markieren und Nachweisen von DNA-Sonden hat das Verfahren der in situ-Hybridisierung sicher, leicht durchführbar und weniger mühsam bei der Verarbeitung der Ergebnisse gemacht. Fluoreszenzfarbstoffe sind weich und einfach zu verwenden, können unbegrenzt gelagert werden, bieten eine hohe Auflösung und ermöglichen die gleichzeitige Untersuchung mehrerer DNA-Sequenzen.

Sonden: einzelsträngige/doppelsträngige DNA/RNA primär/sekundär markierte Sonden. Sonden werden markiert: 1) direkt: durch Insertion von Nukleotiden, an die ein Fluorochrom gebunden ist (PCR oder Nick-Translation) 2) durch ein Reportermolekül (z. B. Digoxigenin, Biotin), an das fluoreszenzmarkierte Antikörper gebunden sind. Um das Signal zu verstärken, können Sie sekundäre, tertiäre usw. Antikörper verwenden, die mit einem Fluoreszenzmarker markiert sind. DNase nickt DNA Nick Translation DNA-Polymerase I fügt neue Nukleotide zum 3'-Hydroxyl hinzu DNA-Polymerase I entfernt einzelne Basen vom 5'-Ende Chromosomenbildgebung: unter Verwendung von DAPI (2 mg/ml). 4', 6-Diamidino-2-phenylindol; starke Bindung an A-T-reiche DNA-Regionen; Anregung mit UV-Licht; Emission 461 nm (blau).

Derzeit gibt es mehrere Hauptansätze, die von der modernen molekularen Zytogenetik weit verbreitet sind: Identifizierung des Materials erweiterter Chromosomenregionen und ganzer Chromosomen. Nachweis einer bestimmten DNA-Sequenz im interessierenden Bereich. Analyse des Ungleichgewichts einzelner Chromosomenregionen. Um das Material erweiterter chromosomaler Regionen und ganzer Chromosomen zu identifizieren, werden häufig chromosomenspezifische und regionsspezifische DNA-Sonden („Painting Probes“) verwendet.

Eigenschaften verschiedener Arten von Sonden 1. Locus-spezifische Sonden (LSI – locus – spezifische Identifikatoren, die an bestimmte Regionen von Chromosomen binden.) Diese Sonden werden verwendet, um die verfügbare kurze (sich nicht wiederholende) Sequenz von isolierter DNA zu identifizieren, die verwendet wird um eine markierte Sonde und ihre anschließende Hybridisierung mit einem Chromosomensatz herzustellen. Sie dienen dem Nachweis diagnostisch und prognostisch signifikanter Chromosomenaberrationen bei verschiedenen pathologischen Zuständen (Monosomie und Trisomie für einzelne Chromosomen). Die weiteste Verwendung dieser Proben fand sich in der pränatalen zytogenetischen Diagnostik, insbesondere bei Untersuchungen von Choriongewebezellen und Interphasekernen von Amniozyten.

2. DNA-Sonden für telomerische Regionen von Chromosomen (TEL-Telomer-Sonde) dienen zum Nachweis von Deletionen und Umlagerungen, die die terminalen Regionen von Chromosomenarmen betreffen. Solche Sonden sind spezifisch für die p- oder q-Arme von Chromosomen und sind komplementär zu einer etwa 300 kb langen Region. vom Ende des Chromosoms. In der Regel sind DNA-Sonden für kurze und lange Chromosomenarme mit unterschiedlichen Fluorochrome assoziiert, was es ermöglicht, beide telomeren Regionen des Chromosoms auf einem zytogenetischen Präparat nachzuweisen.

3. Zentromer-Repeat-Sonden, Alpha- oder Chromosomenzähler (CEP - centromere. Enumeration. Probe) sind chromosomenspezifische DNA-Sonden, die durch Sequenzen von Tandem-Alpha- und Beta-Satelliten-Repeats dargestellt werden. Diese Wiederholungen befinden sich überwiegend in den zentromeren oder perizentromeren Heterochromatinregionen von Chromosomen. Mit ihrer Hilfe kann jedes Chromosom in einer anderen Farbe lackiert werden, wodurch Sie schnell die Anzahl der Chromosomen und Abweichungen von ihrer normalen Anzahl bestimmen können, die zu einzelnen Abschnitten des Chromosoms komplementär sind, aber als Ganzes seine gesamte Länge abdecken. Unter Verwendung einer Bibliothek solcher Sonden kann man das gesamte Chromosom "färben" und einen differentiellen spektralen Karyotyp eines Individuums erhalten. Diese Art der Analyse wird verwendet, um Chromosomenaberrationen zu analysieren, z. B. Translokationen, wenn ein Stück eines Chromosoms auf die Schulter eines anderen übertragen wird.

Anwendungen FISH wird häufig verwendet, um die folgenden klinischen diagnostischen Aufgaben zu lösen: 1. Pränatale Periimplantation und Diagnose von Chromosomenanomalien. Wird in Kliniken für In-vitro-Fertilisation (IVF) und Perinatalzentren verwendet. Ermöglicht rechtzeitig (vor der Implantation des Embryos bei IVF oder in den frühen Stadien der fötalen Entwicklung), genetische Störungen beim ungeborenen Kind zu erkennen und die erforderlichen Maßnahmen zu ergreifen. 2. Onkohämatologie. Onkohämatologische Erkrankungen entstehen durch verschiedene Chromosomenaberrationen, daher werden für deren Diagnostik entsprechende CEP- und LSI-Sonden eingesetzt. 3. Diagnose von soliden Tumoren. Derzeit werden immer mehr kausale Zusammenhänge zwischen der Entstehung bestimmter Krebsarten und spezifischen Veränderungen im Erbgut für sie hergestellt. Daher ist bei Verwendung geeigneter DNA-Sonden eine onkologische FISH-Diagnostik möglich.

Interphase-Zytogenetik: Kombination von FISH mit anderen Methoden: - FISH-Immunphänotypisierung (FICTION); + FICTION (Fluorescence Immunophenotyping and Interfase Cytogenetics as a Tool for Investigation Of Neoplasms) – für die Untersuchung von Tumorzellen. Für diese Analyse werden ungefärbte Ausstriche von Blut, Knochenmark oder Präparaten anderer Gewebe verwendet. Stufe 1 – Präparate werden mit spezifischen monoklonalen Antikörpern inkubiert, Stufe 2 – Konjugation mit Fluorophoren wird zur anschließenden Visualisierung des Antigen-monoklonalen Antikörper-Komplexes durchgeführt. Stufe 3 - In-situ-Hybridisierung mit DNA-Sonden durchführen. Farblich unterschiedliche Fluorophore werden zum Nachweis von monoklonalen Antikörpern und DNA-Sonden verwendet. Die Untersuchung des Präparats unter einem Fluoreszenzmikroskop mit dem erforderlichen Filtersatz ermöglicht die gleichzeitige Analyse des Immunphänotyps der Hybridisierung und der Signale in den Interphasekernen.

Chromosomale Deletion von TNFAIP 3 in c. HL nachgewiesen durch Interphase-Zytogenetik. FICTION Analysen von. Vertreter c. HL-Fälle zusammengefasst. CD 30-Expression (rot) und FISH-Sonden für TNFAIP 3 und Chromosom 6-Zentromer (blau [b]). In den zweifarbigen Assays in A–C und E und F ist die TNFAIP 3-Sonde grün markiert (g); in dem in D angewendeten Dreifarbentest ergibt die TNFAIP 3-Sonde ein g/orange kolokalisiertes (co) Signal. Zwei unterschiedliche Strategien werden verwendet, um zwei- und dreifarbige FISH-Assays in Kombination mit CD 30-Immunfluoreszenz anzuzeigen; ich. e. , zweifarbige Assays (A–C und E und F) werden unter Verwendung einer dreifarbigen Anzeige gezeigt, während eine falsche mehrfarbige Anzeige, wie sie von der Isis-Software erhalten wird, für den dreifarbigen Assay (D) angewendet wird, um gleichzeitig vier Farben anzuzeigen ( dh CD 30 [r], TNFAIP 3 [g] und Orange und Chromosom 6 Zentromer [b]).

Die digitale Aufzeichnung von Mikrobildern hat die Möglichkeit eröffnet, nicht nur Kombinationen von Fluorophoren, sondern auch ihre Verhältnisse und Intensitäten in Pseudofarben umzuwandeln

Multicolor-Färbung von Chromosomen (Muli. Color Banding - MSV) Diese Methode ist nicht für eine vollständige Analyse aller Chromosomen gedacht, sondern für eine detaillierte Analyse eines einzelnen Chromosoms. Locus-spezifische DNA-Sonden werden mit unterschiedlichen Fluorophoren oder Kombinationen von Fluorophoren markiert, so dass der Signalpegel jeder der DNA-Sonden in seiner Intensität variiert. Überlappende Intensitätsprofile von DNA-Sondensignalen liefern Variationen in den Verhältnissen von Fluoreszenzintensitäten verschiedener Fluorophore entlang des Chromosoms. Intensitätsverhältnisse können in Pseudofarben übersetzt werden, und somit hat jeder Punkt des Bildes und folglich jeder der Chromosomenorte seine eigene Pseudofarbe. Diese Version der Multicolor-FISH-Methode erwies sich als hochwirksam bei der Analyse nicht nur von interchromosomalen, sondern auch von intrachromosomalen Rearrangements bei onkologischen Erkrankungen. Für eine erfolgreiche Anwendung ist es jedoch notwendig, zunächst das zu untersuchende Chromosom zu bestimmen. Diese Methode der molekularen Zytogenetik eignet sich zur Analyse von Karyotypstörungen, die mit bestimmten Chromosomen assoziiert sind.

Bis heute wurden Sätze von DNA-Sonden erstellt, die MCV für alle menschlichen Chromosomen auf Chromosom 5 liefern; mehrfarbige Banden von Chromosom 5; Idiogramm von Chromosom 5; für MSV verwendete Fluorochrome).

Die Metaphasen-Zytogenetik, die historisch früher als die Interphasen-Zytogenetik entstanden ist, ermöglicht die Bestimmung eines breiten Spektrums von Chromosomenstörungen, aber dafür ist es notwendig, dass sich die untersuchten Zellen im Metaphasenstadium der Meiose befinden.

Multicolor-Karyotypisierung Die Analyse erfolgt mit DNA-Sonden mit kontinuierlicher Färbung der Arme oder ganzer Chromosomen (WCP-Sonden - Whole Chromosome Paint). Solche Sonden hybridisieren mit zahlreichen kurzen DNA-Sequenzen, die sich entlang der gesamten Länge des Chromosoms befinden. Somit erscheint das Chromosom bei Betrachtung unter einem Fluoreszenzmikroskop einheitlich in einer bestimmten Farbe gefärbt.

Die für diese Analyse verwendeten DNA-Sonden bestehen aus einer Mischung fester Färbesonden für den vollständigen Satz menschlicher Chromosomen, die mit einer Kombination mehrerer Fluorochrome markiert sind, deren Verhältnis für jedes Chromosomenpaar individuell ausgewählt wird. Der Einsatz geeigneter Registrierungsverfahren und Computerprogramme zur Bildanalyse, die für jeden Bildpunkt die Intensität der Lumineszenz aller Fluorochrome auswerten, ermöglicht eine Karyotypisierung, bei der jedes Chromosomenpaar seine eigene, einzigartige „Pseudofarbe“ hat ".

M-FISH (multitarget multifluor multicolor oder multiplex. FISH) ist der generische Name für traditionelles mehrfarbiges FISH, das Fluorochrom-spezifische Filtersätze verwendet. Das M-FISH-Prinzip besteht in der getrennten digitalen Aufzeichnung des Signals aller verwendeten Fluorochrome, was durch sequentiell wechselnde Filtersätze erreicht wird. Alle Bilder werden in separaten Dateien aufgezeichnet, was eine effiziente Verarbeitung im Zusammenhang mit Signal- und Hintergrundtrennung sowie Signalquantifizierung ermöglicht. Die Verarbeitung aller aufgezeichneten Informationen mit Hilfe einer speziellen Software übersetzt Informationen über den Pegel von Fluorochromsignalen an jedem Punkt des Bildes in Falschfarben. Eine der Hauptbeschränkungen der Anzahl der verwendeten DNA-Sonden ist die Anzahl der verfügbaren Fluorochrome mit nicht überlappenden Anregungs- und Emissionsspektren und die Verfügbarkeit geeigneter Filtersätze.

24-Farben-FISH Das am weitesten verbreitete M-FISH ist 24-Farben-FISH zur gleichzeitigen Identifizierung von Material aller menschlichen Chromosomen. Es ist hocheffizient beim Nachweis chromosomaler Translokationen, ist jedoch nicht zum Nachweis von Deletionen und Inversionen ausgelegt. Dieses Problem kann jedoch teilweise durch gleichzeitige Färbung von Chromosomen mit DAPI gelöst werden, was es ermöglicht, die differentielle Streifung von Chromosomen zu analysieren, deren Chromosomenmaterial bereits identifiziert wurde. Leider sollte angemerkt werden, dass die Qualität der Chromosomen-DAPI-Bandenbildung nach M-FISH der GTG-Differenzialfärbung und sogar der DAPI-Bandenbildung nach herkömmlicher in situ-Hybridisierung deutlich unterlegen ist.

Empfang. FISH Das M-FISH-Prinzip wurde verwendet, um einen mehrfarbigen Strichcode für menschliche Chromosomen und ein mehrfarbiges Chromosomen-Banding-Verfahren zu erzeugen, das auf einer Interspezies-in-situ-Hybridisierung basiert. Im Gegensatz zum 24-Farben-FISH ermöglicht diese Methode den direkten Nachweis eines Teils der intrachromosomalen Rearrangements. In Rx verwendete DNA-Sonden. FISH markiert mit einer Kombination aus 3 Fluorochrome, die 7 Pseudofarben liefert. Sie färben gezielt einzelne Regionen von Chromosomen und erzeugen ihre Farbstreifen. Dieses Merkmal von DNA-Proben für Rx. FISCH wird durch die Art der Gewinnung bestimmt. Sie sind chromosomenspezifische DNA-Bibliotheken von zwei Gibbonarten: Hylobates concolor und Hylobates syndactylus.

Als Ergebnis der intensiven chromosomalen Umlagerungen, die während der Entstehung moderner Gibbonarten stattfanden, stellte sich heraus, dass das Material ihrer Chromosomen im Vergleich zur Chromosomenorganisation beim Menschen, dessen Chromosomen für ihren Konservatismus bekannt sind, stark gemischt war. Das Verhältnis von menschlichem Chromosom 1 zu Gibbon-Chromosomen ist in Abbildung 1 dargestellt.

Fig. 2 zeigt eine allgemeine Ansicht menschlicher Chromosomen, die als Ergebnis von Rx erhalten wurden. FISCH. a) Metaphasenplatte b) Anordnung der Chromosomen.

RXFISH hat jedoch schwerwiegende Einschränkungen – Chromosomenumlagerungen, die innerhalb einer RX-Farbbande stattgefunden haben, können mit dieser Methode nicht erkannt werden, es sei denn, sie führen zu signifikanten und leicht sichtbaren Veränderungen in der Größe dieser Bande. - Sonden färben mehrere chromosomale Regionen verschiedener Chromosomen in einer Pseudofarbe. Da jedoch die Anzahl der verwendeten Fluorochrome zunimmt, wird die RXFISH-Methode zweifellos informativer sein als das routinemäßige 24-Farben-FISH.

Zu den Vorteilen von RXFISH gehören derzeit folgende Punkte: Das Verfahren erlaubt die Analyse des gesamten menschlichen Genoms in einem einzigen Multicolor-FISH-Experiment. Kommerziell erhältliche Sätze markierter DNA-Sonden und die erforderlichen Nachweissysteme sind erhältlich. Das Verfahren ermöglicht die schnelle Identifizierung eines signifikanten Teils der intra- und interchromosomalen Umlagerungen. Eine automatische Identifizierung von Metaphase-Chromosomen mit „Color Banding“ ist möglich. Jedes menschliche Chromosom hat einen eindeutigen Farbbarcode. RXFISH ist in die Cyto-Workstation integriert. Vision- und Standard-Fluoreszenzmikroskopiesysteme.

Spektrale Karyotypisierung (SKY-spectralkaryotyping) Die Grundprinzipien der mikroskopischen Bildanalyse bei der spektralen Karyotypisierung sind praktisch die gleichen wie bei M-FISH. Die Unterschiede beziehen sich auf die Art und Weise, wie das Bild registriert wird. Die SKY-Technologie ermöglicht es Ihnen, Spektralkurven für alle Bildpunkte während einer Messung zu erhalten, unabhängig davon, ob es sich um eine Epifluoreszenz oder um eine herkömmliche Lichtmikroskopie handelt. Für die spektrale Karyotypisierung aller menschlichen Chromosomen werden fünf Fluorochrome verwendet, eines im grünen Spektrum, zwei im roten und zwei im Infraroten. Die Anregung und Emission aller Fluorochrome, die zur Markierung von DNA-Sonden verwendet werden, erfolgt mit einem Filtersatz, wodurch deren sequentielle Änderung, Zwischenfokussierung und damit verbundene Probleme, wie z. B. räumliche Verschiebung des Bildes, Bestimmung von Schwellenwerten, vermieden werden können und Segmentierungsmasken . Basierend auf der Analyse der Spektralkurven wird das Vorhandensein oder Fehlen spezifischer Fluorochrome an einem bestimmten Punkt bestimmt.

Der nächste Schritt ist das Klassifizierungsverfahren, mit dem Sie die chromosomale Zugehörigkeit des analysierten Materials direkt und eindeutig bestimmen können. Dies gewährleistet eine zuverlässige Identifizierung (bis zum Chromosom) von Marker-Chromosomenmaterial sowie von Chromosomenderivaten, die aus verschiedenen Umlagerungen resultieren. Der große Vorteil von SKY ist, dass die DAPI-Färbung parallel zum Spektralbild registriert wird. Die Software-Verbesserung der DAPI-Streifenbildung ermöglicht es, eine differenzielle Streifenbildung in einer Qualität zu erreichen, die der von GTG-Streifenbildung nahe kommt. Die Möglichkeit der parallelen Analyse des Spektralbildes und der qualitativen Differenzfärbung von Chromosomen vereinfacht die Interpretation der SKY-Ergebnisse erheblich und ermöglicht eine genauere Bestimmung der Chromosomenbruchstellen. Zu den unbestrittenen Vorteilen von SKY gehört die Möglichkeit, Fluorochrome mit überlappenden Anregungs- und Emissionsspektren zu verwenden, was die Liste der verwendbaren Fluorochrome erheblich erweitert und auch die Anzahl der gleichzeitig verwendbaren Fluorochrome erhöht. Die Listung eines neuen Fluorochroms erfordert nicht den Kauf eines neuen Filtersatzes, da für SKY eine Filtereinheit für Spektral-FISH und eine Filtereinheit für DAPI ausreicht.

Zu den Nachteilen von SKY gehören: - lange Belichtungszeit, die für die Aufnahme mikroskopischer Bilder erforderlich ist. - SKY ist etwas weniger effizient als M-FISH, wenn es um die Forschung mit relativ kleinen DNA-Sonden geht.

Farbwechselnde Karyotypisierung (CCKs Farbwechselnde Karyotypisierung) Dieses Verfahren basiert auf der Analyse des Unterschieds in der Signallänge zwischen DNA-Proben, die mit DNA-Sonden hybridisiert wurden, die mit Fluorochrome assoziiert sind, und DNA-Sonden, die Antikörper tragen. Das Verfahren ist mit nur 3 Filtern durchführbar und erfordert keine speziellen Kameras und Software. Um Chromosomen zu identifizieren, wird eine Hybridisierung durchgeführt und zwei Bilder werden erhalten. Das Verfahren basiert auf dem Unterschied in der Länge des Fluoreszenzsignals, da die Expositionszeit von DNA-Proben, die mit Antikörpern assoziiert sind, um 80–90 % kürzer ist als die von Proben, die mit Fluorochrome assoziiert sind. Nach der Hybridisierungsreaktion werden die Tupfer den entsprechenden primären Antikörpern ausgesetzt und dann sichtbar gemacht, um das erste Bild zu erhalten. Die Objektträger werden dann sekundären Antikörpern und Avidin ausgesetzt, die an die gleichen Fluorochrome gebunden sind. Die Striche können mit DAPI gegengefärbt werden.

Zukünftig werden Bilder der Präparate wiederum mit 3 Filtern im Wechsel gewonnen. Diese Bilder werden mit einer speziellen Software verglichen und ein zweites Bild erhalten, in dem nur die mit bestimmten Antikörpern verbundenen Chromosomen sichtbar sind. Daher fluoreszieren einige Chromosomen nur auf dem ersten oder zweiten Bild, während andere ihre Farbe auf verschiedenen Bildern ändern.

Vergleichende genomische Hybridisierung (CGH) Die Methode wurde entwickelt, um quantitative Störungen im Genom zu identifizieren. Es basiert auf der Durchführung einer in situ-Hybridisierungsreaktion unter Verwendung des gesamten Genoms als DNA-Sonde. Die isolierte und normale Spender-DNA wird mit verschiedenfarbigen Fluorochrome markiert und damit zu DNA-Sonden. Äquivalente Mengen dieser Sonden werden gemischt und bei der Hybridisierung mit einem zytogenetischen Kontrollpräparat verwendet. Nach FISH werden Metaphasen auf einem Fluoreszenzmikroskop analysiert, wobei ein spezielles Computerbildanalyseprogramm verwendet wird, um die Fluoreszenzintensität von zwei Fluorochrome entlang der gesamten Länge jedes Chromosoms zu bestimmen.

In Abwesenheit quantitativer Veränderungen im Karyotyp der Testprobe wird ein bestimmtes Verhältnis der Lumineszenzintensität der beiden Fluorochrome beobachtet. Bei einer Genamplifikation wird die Intensität des Signals des entsprechenden Fluorochroms zunehmen, bei Verlust eines Teils des Erbguts dagegen schwächer. Somit ermöglicht CGH den Nachweis eines genomischen Ungleichgewichts, jedoch kann diese Methode nicht zum Nachweis balancierter Translokationen und Inversionen verwendet werden, und Trisomien und Deletionen können nur nachgewiesen werden, wenn die Größe der unbalancierten Region mindestens 10 Millionen Basenpaare beträgt.

Das chromosomale Ungleichgewicht in der Testprobe wird aus der Differenz der Fluoreszenzintensität zweier verschiedener Fluorochrome durch Berechnung des Fluoreszenzverhältnisses (FR) geschätzt.

Die CGH-Methode hat gegenüber anderen Methoden zur Analyse von Genomveränderungen eine Reihe von Vorteilen: Erstens ist sie unabhängig von der Quelle des Untersuchungsmaterials und kann mit einer geringen Menge an getesteter DNA, einschließlich Archivmaterial, erfolgreich durchgeführt werden. Zweitens ermöglicht es, in einem einzigen Experiment detaillierte Informationen über den Verlust oder die Zunahme der Anzahl von Kopien des genetischen Materials im gesamten Genom zu erhalten. Drittens erfordert das CGH-Verfahren nicht die Herstellung von Präparationen von Metaphase-Chromosomen aus dem untersuchten Gewebe, das heißt, es hängt nicht vom Zellkulturverfahren und damit verbundenen Artefakten ab.

Die genomische situ-Hybridisierung (Genomicin situ-Hybridisierung, GISH) ist eine Variante des situ-Hybridisierungsverfahrens, das darin besteht, dass zur Hybridisierung mit fixierten Proben die gesamte genomische DNA einer Organismenart als fluoreszenzmarkierte Sonde verwendet wird die mit der gesamten genomischen DNA einer anderen Organismenart konkurriert; verwendet, um Interspezies- und Intraspezies-Unterschiede in Genomen, chromosomale Umlagerungen, Deletionen und Substitutionen zu bestimmen.

FISH-Variationen 1) Q-FISH – quantitativer FISH: Entwickelt von Lansdorp et al.: U. M. Martens, J. M. Zijlmans, S. S. Poon, W. Dragowska, J. Yui, E. A. Chavez, R. K. Ward und P. M. Lansdorp. 1998. Kurze Telomere auf dem menschlichen Chromosom 17 p. Nat. Genet. 18:76-80. quantitative Methode. Entwickelt für die Arbeit mit Durchflusszytometrie. Ursprünglich verwendet, um die Chromosomenlänge (Auflösung: 200 bp) durch Zählen der Anzahl der Telomerwiederholungen zu messen. Es werden PNA-konjugierte Sonden verwendet. Anfänglich wurden Metaphase-Chromosomen (eigentliches QFISH) untersucht, jetzt ist diese Methode auch auf Interphase-Chromosomen (IQ-FISH) anwendbar. Q-FISH wird an Zellkulturen, Gewebeschnitten (beides auf Gläsern) durchgeführt. Derzeit ist Q-FISH ein wichtiges Werkzeug zur Erforschung der Rolle von Telomeren bei Alterungsprozessen und Krebsentstehung.

PNA-FISH - Peptid-Nukleinsäuren FISH: Peptid-Nukleinsäuren (PNAs) sind synthetische DNA-Analoga, bei denen das Zuckerrückgrat von Desoxyribosephosphat, das die stickstoffhaltige Base trägt, durch ein ungeladenes Peptidrückgrat ersetzt ist. Als Ergebnis dieser Struktur: tritt keine elektrostatische Abstoßung auf, wenn die PNA-oligomere Sonde mit komplementärer DNA/RNA hybridisiert. PNA-DNA (PNA-RNA)-Duplexe sind viel stabiler als natürliche Homo/Heteroduplexe. Hohe Spezifität der PNA-DNA-Bindung: Die PNA-DNA-Hybridisierung ist viel empfindlicher gegenüber Basenpaarfehlpaarungen als die DNA-DNA-Hybridisierung. Somit können unter Verwendung einer PNA-Sonde zwei zentromerische Wiederholungen unterschieden werden, die sich nur in einem Basenpaar unterscheiden. PNA hat eine relative Hydrophobie (im Vergleich zu DNA), wodurch PNA besser durch Zellwände diffundiert => breite Anwendung in der Mikrobiologie. Basierend auf der hohen Bindungsspezifität: Es wird angenommen, dass die PNA-Technologie bald die Grundlage für die Schaffung allelspezifischer Sonden für die in situ-Hybridisierung werden wird. Es wird in der Genetik, Zytogenetik, Epigenetik, Mikrobiologie usw. verwendet.

3) Flow-FISH – FISH für Durchflusszytometrie: Vorgeschlagen 1998 von: Rufer, N., Dragowska, W., Thornbury, G., Roosnek, E. & Lansdorp, PM Telomerlängendynamik in menschlichen Lymphozytensubpopulationen, gemessen durch Durchflusszytometrie . Natur Biotechnologie. 16, 743–747 (1998). Eine Kombination aus Q-FISH und Durchflusszytometrie, die eine Signalanalyse (Messung) und Sortierung ermöglicht. Für Flow-FISH wird eine Zellsuspension (zur Messung der Länge von Chromosomen-Telomeren), Chromosomenspreads und isolierte Chromosomen (zur weiteren Kartierung) verwendet. Wie bei Q-FISH werden PNA-getaggte Telomer-Sonden verwendet (z. B. zur Bildgebung und Messung der Länge von Telomer-Repeats) Der Hauptvorteil ist eine schnellere Methode (Analyse/Sortierung einer großen Anzahl von Zellen/Chromosomen). Es wird häufig verwendet, um verschiedene Probleme zu untersuchen: Alterung, Erhaltung der Telomere, Untersuchung hämatopoetischer Stammzellsuspensionen ex vivo, Untersuchung von Bakterien.

Die multiparametrische Analyse ermöglicht die Differenzierung von Zelltypen innerhalb einer Probe, was eine interne Kontrolle und die Analyse von Leukozyten-Subtypen ermöglicht.

Vorteile von Flow-FISH: Leicht reproduzierbare Ergebnisse Möglichkeit zur Analyse von Untergruppen von Zellen in einer Population mithilfe von physikalischer Immunfluoreszenz und Markern Bessere Leistung als Q-FISH Möglichkeit zur Quantifizierung der Fluoreszenz von Tausenden von Zellen.

UNTERSUCHUNG VON ISOLIERTEN CHROMOSOMEN DURCH DURCHFLUSSZYTOMETRIE 1. Chromosomensortierung durch Durchflusszytometrie – Die Karyotypisierung durch Durchflusszytometrie wird für die weitere Genkartierung und den Aufbau von Chromosomenbibliotheken verwendet. - Die Identifizierung und Lokalisierung von Genen auf sortierten Chromosomen erfolgt mit anschließender Verwendung von FISH-Methoden / PRINS-Methode (primed in situ labeling) oder deren Variationen und chromosomenspezifischer PCR. - Bis 2011 wurden bisher nur die Chromosomen von 17 Kulturpflanzenarten erfolgreich sortiert. - Sortierung von Metaphase- oder Pachytän-Chromosomen mit einem hohen Teilungsindex.

Fluoreszierende Markierung: - Chromosomen sind mit nukleinsäurespezifischen Fluorochrome markiert. - Fluorochrome werden gemäß 1) Spezifität für stickstoffhaltige Basen, 2) experimentellen Bedingungen (einschließlich Berücksichtigung der Wellenlängen verfügbarer Laser) ausgewählt. 1. Verwenden Sie für die monovariante Analyse Farbstoffe, die nicht spezifisch für AT- oder GC-Dämpfe sind: Propidiumiodid (Anregungspeak: 535 nm, Emissionen: 617 nm, Laser erforderlich: 488-nm-Argonlaser oder -lampe + Langpassfilter) Ethidiumbromid ( Anregungspeaks: 300 und 520 nm, Emissionen: 600 nm, erforderlicher Laser: 488 nm Argonlaser oder Lampe + Langpassfilter) Diese Markierungen färben DNA unabhängig vom Gehalt an A, G, T oder stickstoffhaltigen Basen. 2. Für die bivariate Analyse verwenden: Chromomycin (spezifisch für G-C-Basenpaare), Peak A 3 Anregung: 458 nm, Emission 580 nm. Laser: , 458 nm mindestens 400 m. V-Leistung. Hoechst 33258 (spezifisch für A-T bp), Anregung: 351–364 nm, Emission: 470 nm. Laser: 351 -364 nm (stark). Aufgrund der teilweisen Überlappung der Fluorochrom-Spektren müssen die Laser zeitlich und räumlich getrennt werden.

2. Untersuchung von Chromosomen/Nukleotidsequenzen nach dem Sortieren (zum Erstellen physikalischer und genetischer Karten usw.) FISH BAC-FISH PRINS C-PRINS Untersuchung großer Genome mit langen Chromosomen. Kartierung von Sequenzen mit einer großen Anzahl von Wiederholungen (z. B.: telomerische und zentromerische Regionen). Verwendung von kurzen Sonden. Aufgrund der vielen Wiederholungen ist das Signal stark. Standardsondengröße: 15 - 30 Nukleotide. FISCH

FISH-Probleme: Es ist schwierig, Single-Locus-DNA-Sequenzen (d. h. sich nicht wiederholende einzigartige DNA-Sequenzen) zu lokalisieren, da das Signal bei Verwendung kurzer Standardsonden sehr schwach ist. Eine Erhöhung der Sondenlänge auf mehrere Kilobasen zur Verstärkung des Signals führt zu einer verringerten Empfindlichkeit und => unspezifischen Bindung. Lösung: BAC-FISH -BAC-FISH ist eine Kombination aus der FISH-Methode und der Verwendung von genomischen DNA-Klonen, die in bakterielle künstliche Chromosomen (BACs) eingebettet sind, was die Insertion großer DNA-Sequenzen ermöglicht. - Eine effiziente Methode zur Identifizierung und Kartierung einzelner Chromosomen von Organismen mit kleinen Genomen. Als Sonde werden BAC-Sonden, Overgos (überlappende Oligonukleotide) verwendet.

Alternative zu FISH: PRINS PRINS (primed in situ labeling) ist eine Methode zur Chromosomenmarkierung durch Annealing eines Oligonukleotid-DNA-Primers mit einer homologen Sequenz denaturierter chromosomaler DNA und anschließender enzymatischer Verlängerung des Primers in situ mit markierten Nukleotiden. Erstmals beschrieben von Koch et al. 1989 (Koch, JE, Kølvraa, S., Petersen, KB, Gregersen, N., and Bolund, I. (1989) Oligonucleotide-priming methods for the chromosome-specific labeling of alpha satellite DNA in situ. Chromosoma 98, 259 –265). PRINS ist eine Alternative zu FISH. Es wird zur Lokalisierung von Nukleotidsequenzen, Erkennung und Zählung von Metaphase- oder Interphase-Chromosomen oder Chromosomenpaaren (einschließlich chromosomaler Aneuploidie) verwendet. Annealing des unmarkierten Primers (Primer-Primer) mit der interessierenden DNA Elongation des Primers mit Hilfe von thermostabiler DNA-Polymerase und markierten Nukleotiden Terminierung der Reaktion (Anheftung eines blockierenden Moleküls an das 3'-Ende) Primer: PCR-Restriktionsfragment; - indirekt (Biotin/Dig-Fluorochrom-konjugiertes Avidin/Anti-Dig) - Nur ein Paar homologer Chromosomen (ein Chromosom) kann in den Ergebnissen jeder PRINS-Reaktion identifiziert werden. Die nächste PRINS-Reaktion auf demselben Objektträger kann nur nach Blockierung der vorherigen durchgeführt werden. - Wird für DNA-Sequenzen mit einer großen Anzahl von Wiederholungen verwendet.

Vorteile von PRINS: 1. Erfordert minimale Sequenzinformationen, die für die Synthese eines Oligonukleotid-Primers erforderlich sind. 2. Die schnellste und einfachste Methode zum Nachweis einer interessierenden Sequenz auf einem Chromosom (im Vergleich zur Verwendung schwerer FISH-Sonden, die über einen sehr langen Zeitraum hybridisieren). 3. Ausschluss des Sondenmarkierungsschritts. 4. Die Fähigkeit, den Primer mit markierten Nukleotiden zu verlängern, um das c-PRINS-Signal beim Nachweis kurzer einzigartiger Sequenzen zu verstärken. Um Low-Copy-Repeats oder kurze einzigartige Sequenzen zu identifizieren, wird eine empfindlichere Methode verwendet - das zyklische PRINS (c-PRINS). C-PRINS wurde von Gosden et al. vorgeschlagen. 1991 ein verbessertes weit verbreitetes Protokoll von Kubaláková et al. , 2001 (Kubaláková M., Vrána J., Cíhalíková J., Lysák MA, Dole J. (2001). Lokalisierung von DNA-Sequenzen auf Pflanzenchromosomen unter Verwendung von PRINS und C-PRINS. Methods in Cell Science 23: 71-82). C-PRINS umfasst eine Reihe von thermischen Zyklen ähnlich der PCR.

Hüllenflüssigkeit für FISH: -BD Bioscience Standard (GM Baerlocher, I Vulto, G de Jong, PM Lansdorp. Flow Cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH). 2006. Nature Protocols 1, - 2365 – 2376) -40 m. M KCl + 10 m. M Na. Cl (Vrána J, Kubaláková M, Simková H, Cíhalíková J, Lysák MA, Dolezel J. Flow sorting of mitotic chromosomes in common wheat (Triticum aestivum L.). Genetics. 2000; 156(4): 2033-41) -Mg . So 4-Puffer ohne Dithiothreitol (Lj. Li, L. Ma, K. Arumuganathan, YC Song. Flow-sorted chromosomes: a fine material for plant gene physical mapping. Caryologia. 2006, vol. 59, no. 2: 99 -103 ) -autoklaviert 0,1 % (wt/vol) Na. Cl-50m. M Na. Cl (M. Kubaláková, P. Kovářová, P. Suchánková, J. Číhalíková, J. Bartoš, S. Lucretti, N. Watanabe, SF. Kianian, J. Doležel. Chromosome Sorting in Tetraploid Wheat and Its Potential for Genome Analysis. Genetics. 2005, 170(2): 823–829) - Chromosomenstabilisierender Polyaminpuffer (proteinhaltige Hüllenflüssigkeit) (Darzynkiewics Z, Robinson JP, Crissman H. Flow Cytometry, 2. Aufl. Teil B. San Diego, CA. Academic Press, Inc. 1994)

Mit Standardmikroskopen ist es nicht möglich, Zellen auf molekularer Ebene zu untersuchen. Eine kräftige Steigerung allein reicht hier nicht aus. Digitale Bildgebung, zusätzliche Reagenzien und andere Materialien und Instrumente sind erforderlich. Zur Analyse von DNA und RNA wird derzeit ein Verfahren verwendet, das als In-situ-Hybridisierung bezeichnet wird. Da es sich um das Färben von Proben mit anschließender Strahlenanalyse handelt, wird es auch als Fluoreszenzhybridisierung oder FISH bezeichnet.

Fluoreszierende In-situ-Hybridisierung wird häufig in der Genforschung, Krebsdiagnostik, Schwangerschaftsmanagement und vielen anderen Bereichen der Wissenschaft eingesetzt. Das Verfahren basiert, wie der Name schon sagt, auf der Eigenschaft von DNA- und RNA-Molekülen, mit Sonden stabile Bindungen einzugehen, also Hybridmoleküle zu bilden. Die Worte „in situ“ bedeuten, dass alle Beobachtungen „in situ“ gemacht werden, also direkt ohne Verwendung eines zusätzlichen Mediums.

DNA-Sonden (Sonden) sind komplementär zu den Molekülen in der Testprobe. Dazu gehören Nukleoside, die mit Fluorophoren (Substanzen, die dem Molekül die Eigenschaft der Fluoreszenz verleihen) markiert sind. Dieses Verfahren wird als direktes Etikettieren bezeichnet; wenn hybride konjugierte Moleküle als Marker verwendet werden, wird eine indirekte Markierung erhalten. Bei direkter Markierung kann die Hybridisierung unmittelbar nach ihrer Vollendung unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet werden. Für die indirekte Markierung wird ein weiteres Färbeverfahren durchgeführt. Es trennt die konjugierten Moleküle von den untersuchten Proben nach Farbe.

Die Hybridisierungsmethode mit indirekter Markierung erfordert mehr Zeit und Reagenzien, ermöglicht jedoch zuverlässigere Ergebnisse. Der Signalpegel wird in diesem Fall höher sein, und außerdem ist auch dessen stufenweise Verstärkung möglich. Als Markierungssonden werden geklonte DNA-Sequenzen (PCR-Produkte, genomische DNA, markierte Oligonukleotide und andere) verwendet. Die Sondenmarkierung wird auf verschiedene Weise durchgeführt. Gängige Methoden sind die Nick-Translation und die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit markierten Nukleotiden.

Die Reihenfolge des Verfahrens

Die In-situ-Methode beginnt mit einer vorbereitenden Phase – dem Design der Sonden. Die Abmessungen der Sonden sollten nicht groß genug sein, um den Forschungsprozess zu stören. Auch zu kleine Sonden sind unerwünscht, da sie keine zuverlässigen Ergebnisse garantieren. Daher werden Sonden mit einer Größe von bis zu 1.000 bp für die Forschung verwendet. Wenn die Sonde doppelsträngige DNA ist, wird die Säure vor der Hybridisierung denaturiert. Wenn das gewünschte Ergebnis erzielt wird (bestimmte Chromosomenregionen oder alle Chromosomen sind gefärbt), wird die weitere Hybridisierung von DNA-Sonden mit sich wiederholenden Sequenzen blockiert. Dazu werden dem Hybridisierungsansatz unmarkierte DNA-Repeat-Moleküle zugesetzt.

Die nächste Stufe der Forschung ist die Herstellung von Präparationen von Interphase-Kernen oder Metaphase-Chromosomen. Die Zellen werden im Substrat auf dem Glas fixiert, wonach die DNA denaturiert wird. Um die Denaturierungstemperatur zu senken und die Morphologie von Kernen und Chromosomen zu erhalten, wird die Denaturierung unter Zugabe von Formadid durchgeführt. Danach werden dem Material Sonden zugesetzt und mehrere Stunden lang hybridisiert. Nach Abschluss wird ein mehrstufiges Waschen durchgeführt, um Sonden zu entfernen, die sich nicht mit den Probenmolekülen verbunden haben.

Eine moderne Methode der zytogenetischen Analyse, die es ermöglicht, die qualitativen und quantitativen Veränderungen von Chromosomen (einschließlich Translokationen und Mikrodeletionen) zu bestimmen und zur Differenzialdiagnose von bösartigen Bluterkrankungen und soliden Tumoren eingesetzt wird.

Russische Synonyme

Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung

FISH-Analyse

Englische Synonyme

Fluoreszenz vor Ort Hybridisierung

Untersuchungsmethode

Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung.

Welches Biomaterial kann für die Forschung verwendet werden?

Gewebeprobe, Gewebeprobe im Paraffinblock.

Wie bereite ich mich richtig auf die Forschung vor?

Keine Vorbereitung erforderlich.

Allgemeine Informationen zum Studium

Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) in- situ Hybridisierung) ist eine der modernsten Methoden zur Diagnose von Chromosomenanomalien. Es basiert auf der Verwendung von DNA-Sonden, die mit einem Fluoreszenzmarker markiert sind. DNA-Sonden sind speziell synthetisierte DNA-Fragmente, deren Sequenz komplementär zur DNA-Sequenz der untersuchten aberranten Chromosomen ist. Daher unterscheiden sich DNA-Proben in ihrer Zusammensetzung: Verschiedene, spezifische DNA-Proben werden verwendet, um verschiedene Chromosomenanomalien zu bestimmen. DNA-Sonden variieren auch in der Größe: Einige können auf ein ganzes Chromosom gerichtet sein, andere auf einen bestimmten Ort.

Während des Hybridisierungsprozesses binden abweichende Chromosomen in der Testprobe an die DNA-Sonde, was bei Untersuchung mit einem Fluoreszenzmikroskop als Fluoreszenzsignal (ein positives FISH-Testergebnis) bestimmt wird. In Abwesenheit abweichender Chromosomen werden ungebundene DNA-Proben während der Reaktion „ausgewaschen“, was bei Untersuchung mit einem Fluoreszenzmikroskop als Fehlen eines Fluoreszenzsignals definiert wird (negatives FISH-Testergebnis). Das Verfahren ermöglicht es, nicht nur das Vorhandensein eines Fluoreszenzsignals, sondern auch seine Intensität und Lokalisierung zu bewerten. Somit ist der FISH-Test nicht nur eine qualitative, sondern auch eine quantitative Methode.

Der FISH-Test hat gegenüber anderen zytogenetischen Methoden eine Reihe von Vorteilen. Zunächst einmal kann die FISH-Studie sowohl auf Metaphase- als auch auf Interphasekerne, also auf sich nicht teilende Zellen, angewendet werden. Dies ist der Hauptvorteil von FISH gegenüber klassischen Karyotypisierungsmethoden (z. B. Romanowsky-Giemsa-Färbung von Chromosomen), die nur auf Metaphasekerne angewendet werden. Dies macht FISH zu einer genaueren Methode zum Nachweis von Chromosomenanomalien in Geweben mit geringer proliferativer Aktivität, einschließlich solider Tumore.

Da der FISH-Test stabile DNA von Interphasekernen verwendet, kann eine Vielzahl von Biomaterialien für die Forschung verwendet werden - Feinwinkel-Aspirationsbiopsie-Aspirate, Abstriche, Knochenmarksaspirate, Biopsieproben und, was wichtig ist, konservierte Gewebefragmente, wie z. B. histologische Blöcke . So kann beispielsweise ein FISH-Test erfolgreich an wiederholten Präparaten durchgeführt werden, die aus einem histologischen Block einer Brustbiopsie gewonnen wurden, wenn die Diagnose „Brustadenokarzinom“ bestätigt und der HER2/neu-Status des Tumors bestimmt werden muss. Hervorzuheben ist, dass derzeit die FISH-Studie als Bestätigungstest empfohlen wird, wenn ein unbestimmtes Ergebnis der immunhistochemischen Untersuchung des Tumors für den Tumormarker HER2 / neu (IHC 2+) vorliegt.

Ein weiterer Vorteil von FISH ist seine Fähigkeit, Mikrodeletionen zu erkennen, die durch klassische Karyotypisierung oder PCR nicht erkannt werden. Dies ist besonders wichtig bei Verdacht auf DiGeorge-Syndrom und Velokardiofaziales Syndrom.

Der FISH-Test findet breite Anwendung in der Differentialdiagnostik bösartiger Erkrankungen, vor allem in der Onkohämatologie. Chromosomenanomalien in Kombination mit dem klinischen Bild und immunhistochemischen Daten sind die Grundlage für die Klassifizierung, Bestimmung der Behandlungstaktik und Prognose von lympho- und myeloproliferativen Erkrankungen. Klassische Beispiele sind chronische myeloische Leukämie – t (9; 22), akute Promyelozytenleukämie – t (15; 17), chronische lymphatische Leukämie – Trisomie 12 und andere. Bei soliden Tumoren wird die FISH-Studie am häufigsten bei der Diagnose von Brust-, Blasen-, Dickdarm-, Neuroblastom-, Retinoblastom- und anderen Krebsarten eingesetzt.

Die FISH-Studie kann auch in der Pränatal- und Präimplantationsdiagnostik eingesetzt werden.

Der FISH-Test wird häufig in Kombination mit anderen Methoden der molekularen und zytogenetischen Diagnostik durchgeführt. Das Ergebnis dieser Studie wird in Verbindung mit den Ergebnissen zusätzlicher Labor- und Gerätedaten ausgewertet.

Wozu dient die Forschung?

• Zur Differentialdiagnose bösartiger Erkrankungen (Blut und feste Organe).

Wann ist die Studie geplant?

• Wenn Sie das Vorliegen einer bösartigen Blutkrankheit oder solider Tumore vermuten, hängen die Behandlungstaktiken und deren Prognose von der chromosomalen Zusammensetzung des Tumorklons ab.

Was bedeuten die Ergebnisse?

Positives Ergebnis:

• Das Vorhandensein abweichender Chromosomen in der Testprobe.

Negatives Ergebnis:

• Das Fehlen abweichender Chromosomen in der Testprobe.

Was kann das Ergebnis beeinflussen?

• Anzahl der abweichenden Chromosomen.



• Immunhistochemische Untersuchung von klinischem Material (unter Verwendung von 1 Antikörper)
• Immunhistochemische Untersuchung von klinischem Material (unter Verwendung von 4 oder mehr Antikörpern)
• Bestimmung des HER2-Tumorstatus durch FISH
• Bestimmung des HER2-Tumorstatus durch die CISH-Methode

Wer bestellt die Studie?

Onkologe, Kinderarzt, Geburtshelfer-Gynäkologe, Genetiker.

Literatur

• Wan TS, Ma ES. Molekulare Zytogenetik: ein unverzichtbares Werkzeug für die Krebsdiagnose. Anti-Krebs-Res. 2005 Jul-Aug;25(4):2979-83.
• Kolialexi A, Tsangaris GT, Kitsiou S, Kanavakis E, Mavrou A. Auswirkungen zytogenetischer und molekularzytogenetischer Studien auf hämatologische Malignome. Chang Gung Med J. 2012 Mar-Apr;35(2):96-110.
• Mühlmann M. Molekulare Zytogenetik in Metaphase- und Interphasezellen für die Krebs- und Genforschung, Diagnose und Prognose. Anwendung in Gewebeschnitten und Zellsuspensionen. Genet Mol-Res. 30. Juni 2002;1(2):117-27.