Метод флуоресцентної гібридизації in situ (FISH) у діагностиці хромосомних хвороб. Флуоресцентна гібридизація Флуоресцентна гібридизація

• Флуоресцентна гібридизація in situ, або метод FISH (англ. fluorescence in situ hybridization - FISH), - цитогенетичний метод, який застосовують для детекції та визначення положення специфічної послідовності ДНК на метафазних хромосомах або в інтерфазних ядрах in situ. Крім того, FISH використовують для виявлення специфічних мРНК у зразку тканини. В останньому випадку метод FISH дозволяє встановити просторово-часові особливості експресії генів у клітинах та тканинах.

  Метод FISH використовують у преімплантаційній, пренатальній та постнатальній генетичній діагностиці, у діагностиці онкологічних захворювань, у ретроспективній біологічній дозиметрії.

Пов'язані поняття

Мікроядро - у цитології фрагмент ядра в еукаріотичній клітині, що не містить повного геному, необхідного для її виживання. Є патологічною структурою і може спостерігатися у клітинах будь-яких тканин. Зазвичай мікроядра утворюються внаслідок неправильного ходу клітинного поділу чи фрагментації ядра у процесі апоптозу.

Гомологічна рекомбінація, або загальна рекомбінація - тип генетичної рекомбінації, під час якої відбувається обмін нуклеотидними послідовностями між двома схожими або ідентичними хромосомами. Це найбільш широко використовуваний клітинами спосіб усунення двох або однониткових пошкоджень ДНК. Гомологічна рекомбінація також створює різноманітність комбінацій генів під час мейозу, що забезпечують високий рівень спадкової мінливості, що, у свою чергу, дозволяє популяції краще адаптуватися.

Косміди (Cosmides) - плазміди, що містять фрагмент ДНК фага лямбда, включаючи cos-ділянку. Разом із системами упаковки у фагові частинки in vitro використовуються як векторні молекули для клонування генів та при побудові геномних бібліотек. Косміди були вперше сконструйовані Коллінсом та Брюнінгом у 1978 році. Їх назва походить від скорочення двох термінів: cos-ділянка (сам термін у свою чергу походить від англ. cohesive ends – липкі кінці) та плазміда.

У зв'язку з накопиченням величезної кількості інформації про послідовності генів, нині, виявлення функцій генів, часто використовують методи зворотної генетики. Дослідники маніпулюють послідовностями генів, змінюючи або вимикаючи той чи інший ген, та аналізують, до яких змін це призводить. Це шлях зворотної генетики: від гена до ознаки/фенотипу. Пряма та зворотна генетика – не взаємовиключні підходи, а доповнюють одне одного у вивченні функції гена.
(англ. transformation) – процес поглинання бактеріальною клітиною молекули ДНК із зовнішнього середовища. Щоб бути здатною до трансформації, клітина повинна бути компетентною, тобто молекули ДНК повинні мати можливість проникнути в неї через клітинні покриви. Трансформація активно використовується в молекулярній біології та генетичній інженерії.

Негомологічне з'єднання кінців або негомологічне з'єднання кінців (англ. non-homologous end joining, NHEJ) - один із шляхів репарації двониткових розривів в ДНК. Негомологічний цей процес називається тому, що пошкоджені кінці ланцюга з'єднуються лігазом безпосередньо, не потребуючи гомологічного шаблону, на відміну від процесу гомологічної рекомбінації. Термін «негомологічний з'єднання кінців» був запропонований в 1996 Муром і Хабер. NHEJ значно менш точний, ніж гомологічна рекомбінація...

Кулліни (англ. cullins) - сімейство гідрофобних білків, що служать скеффолдом для убіквітінлігаз (E3). Всі еукаріоти, здається, мають кулліни. Вони у поєднанні з RING-білками утворюють куллін-RING убіквітінлігази (CRL), які дуже різноманітні та відіграють роль у багатьох клітинних процесах, наприклад, протеолізі (вони руйнують близько 20 % клітинних білків), епігенетичної регуляції, роботі імунітету рослин, опосередкованого саліциловою кислотою .

Секвенування нового покоління (англ. next generation sequencing, NGS) - техніка визначення нуклеотидної послідовності ДНК і РНК отримання формального описи її первинної структури. Технологія методів секвенування нового покоління (СНП) дозволяє «прочитати» одночасно декілька ділянок геному, що є головною відмінністю від більш ранніх методів секвенування. СНП здійснюється за допомогою циклів, що повторюються, подовження ланцюга, індукованого полімеразою, або багаторазового...

Квантеферон (іноді квантиферон, квантифероновий тест; англ. QuantiFERON) – торгова назва імуноферментного діагностичного тесту туберкульозної інфекції, виробленого американською компанією QIAGEN. Текст використовує технологію ELISA для виявлення гамма-інтерферонів імунної відповіді.

Метод гібридизації in situ* (на місці, лат.) заснований на здатності ДНК або РНК утворювати стійкі гібридні молекули з ДНК/РНК – зондами безпосередньо на препаратах фіксованих хромосом та інтерфазних ядер. За допомогою цього методу можна визначити точне розташування практично будь-якої послідовності ДНК або РНК безпосередньо в клітині, клітинному ядрі або на хромосомах.

Для проведення гібридизації in situпридатні цитологічні чи гістологічні препарати клітин будь-яких тканин чи органів, приготовлені за стандартними методиками. В умовах клінічної цитогенетичної лабораторії використовують препарати культивованих лімфоцитів периферичної крові, клітин цитотрофобласта хоріонального епітелію, культивованих та некультивованих клітин амніотичної рідини, різних тканин з абортного матеріалу, а також мазків клітин букального епітелію та крові.

Метод гібридизації in situ має особливе значення для практичної цитогенетики завдяки розробці неізотопного варіанту, заснованого на використанні зондів, мічених нерадіоактивними модифікованими нуклеотидами. Неізотопні варіанти гібридизації на препаратах (особливо флюоресцентні) мають ряд переваг у порівнянні з ізотопними: велику роздільну здатність, яка дорівнює роздільній здатності мікроскопа (0,1 - 0,2 мкм), відсутність необхідності в статистичній обробці результатів, швидкість і безпеку для здоров'я дослідників

Крім того, комбінація різно модифікованих проб, що виявляються за допомогою різних систем детекції, дозволяє одночасно визначати розташування двох і більше послідовностей ДНК в одній клітині або на одній метафазної платівці. А використання як ДНК-зондів послідовностей, що повторюються, мічених флюорохромами, скорочує час проведення процедури до 7 - 9 годин (класичний неізотопний варіант гібридизації займає два дні, ізотопні варіанти від тижня до місяця), що особливо важливо для пренатальної діагностики. Використання методу FISHу цитогенетичній діагностиці дозволяє ідентифікувати структурні хромосомні перебудови, встановлювати природу маркерних хромосом, проводити аналіз чисельних порушень хромосомного набору як на метафазних хромосомах, так і в інтерфазних ядрах.

Принцип FISH-методу

В основі FISH-методлежить реакція гібридизації між штучно створеним ДНК-зондом та комплементраною йому нуклеотидною послідовністю ядерної ДНК. Молекула ДНК є два спірально з'єднані нуклеотидні ланцюги, а гібридизація можлива тільки в тому випадку, якщо ланцюги розійдуться. Щоб роз'єднати нуклеотидні ланцюги ДНК вдаються до денатурації (для подальшої денатурованої гібридизації повинна бути як ДНК в ядрах досліджуваного зразка, так і сам ДНК-зонд). Після денатурації ДНК-зонд гібридизується з комплементарною нуклеотидною послідовністю і може бути виявлений за допомогою флуоресцентного мікроскопа.

Таким чином, загальний вигляд протоколу для постановки FISHможна уявити у такому вигляді:

1. Підготовка гістологічного чи цитологічного препарату.
Підготовка гістологічного препарату здійснюється за стандартною схемою: вирізка, маркування, проводка, заливка, мікротомія, приміщення зрізу на предметне скло та депарафінізація. При підготовці цитологічного препарату використовуються спеціальні осадження і центрифугування, що дозволяє отримати концентровану суспензію клітин.

2. Попередня обробка (якщо необхідно).
Препарат обробляється протеазами, щоб виключити наявність білків, які ускладнюють гібридизацію.

3. Нанесення ДНК-зонда на препарат та подальша денатурація.
Щоб денатурувати зонд і ДНК зразка, їх обробляють формамідом і нагрівають до температури близько 85-90°С.

4. Гібридизація.
Після денатурації препарат охолоджують до певної температури (37°С у разі клінічних досліджень) та інкубують у вологій камері протягом кількох годин (тривалість інкубації вказана у кожному конкретному протоколі). В даний час для денатурації та гібридизації використовують автоматичні гібридайзери.

5. Промивання.
Після того, як гібридизація завершена, необхідно відмити зонди, що не зв'язалися, які, в іншому випадку, створять фон, що ускладнює оцінку результатів FISH-аналізу. Для промивання зазвичай використовують розчин, що містить цитрат та хлорид натрію (SSC).

6. Контр-фарбування.
За допомогою флуоресцентних барвників (DAPI - 4,6-діамідин-2-феніліндол; йодид пропідію) проводиться фарбування всієї ядерної ДНК.

7. Аналіз результатів з допомогою флуоресцентного мікроскопа. Виконання рутинних операцій (депарафінізація, попереднє оброблення, промивання) може бути автоматизовано.

* - Матеріал підготовлений з урахуванням інформації відкритих джерел.

Гібридизація нуклеїнових кислот in situ Метод заснований на можливості утворення дволанцюжкових гібридів між штучно створюваних на основі одноланцюгових послідовностей (рибо- або дезоксирибо-, оліго- або полінуклеотидних) міченими зондами та комплементарними їм послідовностями в мішенях – аналізованих молекулах ДНК або РНК. Для виявлення ділянок гібридизації ДНК-пробу (ДНК-зонд) мітять якоюсь репортерною групою: радіоактивним ізотопом, флуорохромом, ферментом, що дає фарбування або люмінесцентний продукт, гаптеном, з яким зв'язується мічене тіло і т.д.

Виявляючи гібрид завдяки наявності в зонді репортерної групи можна - оцінити кількість генів, що кодують певний вид РНК, - визначити частку нетранскрибируемой ДНК в геномі, - встановити зчеплення певних генів з одним друг - та їх точне розташування на хромосомах. Метод молекулярної гібридизації має високу чутливість (можна виявити малу кількість міченого зонда (10 -15 і 10 -19 М) і відповідно комплементарної йому послідовності в мішені) та швидкістю аналізу, що дозволяє використовувати цей метод як для дослідницької діяльності так і для діагностики спадкових і інфекційних захворювань у медицині, ветеринарії та рослинництві.

Поява нових технологій молекулярної цитогенетики, заснованих переважно на in situ гібридизації нуклеїнових кислот, значно розширила можливості хромосомної діагностики.

Інтерфазна цитогенетика: 1. Багатобарвний бендінг хромосом (МВС). 2. Флуоресцентна in situ гібридизація (FISH). 3. Комбінація FISH з іншими методами: -цитологія+FISH; -гістологія + FISH; -імунофенотипування + FISH (FICTION); Метафазна цитогенетика: 1. Суцільне фарбування хромосом (Whole painting). 2. Порівняльна геномна гібридизація (CGH). 3. Каріотипування зі зміною кольору (СБК). 4. Багатобарвне каріотипування: спектральне каріотипування (SKY); багатобарвна FISH (M – FISH, M – BAND).

FISH – fluorescence in situ hybridization – цитогенетичний метод, що використовується для детекції та локалізації специфічних послідовностей ДНК на хромосомах, м. РНК та ін. В основі методики лежить гібридизація флуоресцентно міченого ДНК/РНК зонда з комплементарною послідовністю ДНК/РНК. Виявлення мітки відбувається за допомогою мікроскопа флуоресцентного. Метод FISH було введено понад 30 років тому. Він широко поширився як засіб фізичного картування генів на хромосомах. Пізніше він став застосовуватися в інших областях досліджень (в областях клінічної генетики, репродуктивної медицини, токсикології, еволюційної біології, порівняльної та клітинної геноміки та хромосомної біології). На даний момент FISH переважно використовується для побудови фізичних та генетичних карт хромосом, для виявлення структурних перебудов, транслокацій, мікроделецій, генних ампліфікацій в інтерфазних та метафазних хромосомах. В результаті розвитку науки (кращого розуміння хімічних та фізичних властивостей нуклеїнових кислот та хроматину), а також розвитку флуоресцентної мікроскопії та цифрової візуалізації, метод постійно удосконалювався (здійснено покращення чутливості, специфічності, дозволу), та було розроблено багато варіацій даного методу.

1) Cells є droped на склом смужок, що causing chromosomes до spread 4) Chromosomes є counter stained using DAPI 2) Fluorescently labeled probe is placed on chromosomes і sealed. 3) Проба і хромосоми є розвинені, hybridised then washed 5) Slide is viewed under a fluorescent microscope

Загальний вид протоколу для постановки FISH можна представити наступним чином: 1. Підготовка гістологічного або цитологічного препарату. Підготовка гістологічного препарату здійснюється за стандартною схемою: вирізка, маркування, проводка, заливка, мікротомія, приміщення зрізу на предметне скло та депарафінізація. При підготовці цитологічного препарату використовуються спеціальні осадження і центрифугування, що дозволяє отримати концентровану суспензію клітин. 2. Попередня обробка (якщо необхідно). Препарат обробляється протеазами, щоб виключити наявність білків, які ускладнюють гібридизацію. 3. Нанесення ДНК-зонда на препарат та подальша денатурація. Для того щоб денатурувати зонд і ДНК зразка, їх обробляють формамідом і нагрівають до температури близько 85 -900 С.

4. Гібридизація. Після денатурації препарат охолоджують до певної температури (370°С у разі клінічних досліджень) та інкубують у вологій камері протягом кількох годин (тривалість інкубації вказана у кожному конкретному протоколі). В даний час для денатурації та гібридизації використовують автоматичні гібридайзери. 5. Промивання. Після того, як гібридизація завершена, необхідно відмити зонди, що не зв'язалися, які, в іншому випадку, створять фон, що ускладнює оцінку результатів FISH-аналізу. Для промивання зазвичай використовують розчин, що містить цитрат та хлорид натрію (SSC). 6. Контр-фарбування. За допомогою флуоресцентних барвників (DAPI - 4, 6-діамідин-2 феніліндол; йодид пропідію) проводиться фарбування всієї ядерної ДНК. 7. Аналіз результатів за допомогою флуоресцентного мікроскопа Виконання рутинних операцій (депарафінізація, попереднє оброблення, промивання) може бути автоматизовано.

Дослідження тіломірних ділянок з допомогою флуоресцентного мікроскопа. Поєднані зображення, отримані на стадії інтерфази (ядро) та метафази (окремі хромосоми). синє фарбування - DAPI.

Переваги FISH - способу: 1. можливість вивчення генетичного матеріалу в інтерфазних ядрах; 2. отримання об'єктивних результатів за принципом "так/ні" - це кількісний метод; 3. відносно проста інтерпретація результатів; висока роздільна здатність. Недоліки FISH - методу: 1. флуоресцентні барвники швидко "вицвітають"; 2. для аналізу результатів необхідні високоякісний флуоресцентний мікроскоп.

В основі методу FISH лежить реакція гібридизації між створеним за спеціальними технологіями ДНК - зондом, що є нуклеотидною, послідовністю обмеженого розміру, і комплементарною йому ділянкою ядерної ДНК досліджуваного цитогенетичного препарату. ДНК-зонд-головний елемент для постановки FISH несе "мітку", тобто містить нуклеотиди, безпосередньо пов'язані з флуорохромом або гаптеном для подальшої візуалізації антитілами, що несуть флуорохром. Незв'язана мічена ДНК відмивається, потім проводиться детекція гібридизованого ДНК-зонда з використанням флуоресцентного мікроскопа.

Перебіг ДНК поділяють на пряме та непряме. Пряме перебіг введення в ДНК репортерних елементів – флуорохромів (родаміну, діетиламінокумарину, техаського червоного та ін.). Непрямий метод мічення - ДНК-пробу попередньо кон'югують з проміжними лігандами (біотином, діоксигеніном, 2, 4-дінітрофенолом), присутність яких на цитологічному препараті потім виявляється за допомогою флуорохромів. В цьому випадку чутливість методу набагато зростає, тому що ліганд може містити декілька сайтів взаємодії з флуорохромом. Вперше in situ гібридизація з 32 Р-міченим зондом була описана у 1969 році. Розробка нерадіоактивних систем мічення та детекції ДНК зондів зробила метод in situ гібридизації безпечним, простим у виконанні та менш трудомістким при обробці результатів. Флуоресцентні барвники є м'якими і простими у вживанні, можуть зберігатися невизначено довго, дають високу роздільну здатність і дозволяють одночасно досліджувати кілька послідовностей ДНК.

Зонди: одноланцюгові/дволанцюгові ДНК/РНК первинно/вторинно мічені зонди. Зонди мітяться: 1) безпосередньо: шляхом вставки нуклетидів, до яких прикріплений флюорохром (ПЛР або nick translation); 2) через репортерну молекулу (пр: digoxigenin, biotin) до якої кріпляться флюоресцентно мічені антитіла. Для посилення сигналу можна використовувати вторинні, третинні тощо антитіла, мічені флюоресцентною міткою. DNase nicks DNA Nick Translation DNA polymerase I adds нові nucleotides до 3' hydroxyl DNA polymerase I removes individual bases from the 5' end Візуалізація хромосом: за допомогою DAPI (2 mg/ml). 4', 6 -diamidino-2 -phenylindole; сильне зв'язування з A-T багатими ділянками ДНК; збудження UV світлом; емісія 461 nm (blue).

В даний час можна виділити кілька основних підходів, які широко використовуються сучасною молекулярною цитогенетикою: Ідентифікація матеріалу протяжних хромосомних районів і цілих хромосом. Детекція в районі конкретної послідовності ДНК. Аналіз порушення балансу окремих хромосомних районів. Для ідентифікації матеріалу протяжних хромосомних районів і цілих хромосом широко використовуються специфічні хромосом і район-специфічні ДНК-зонди (“painting probes”).

Характеристика зондів різних типів 1. локус-специфічні зонди (LSI - locus - specific identifiers, що зв'язуються з певними ділянками хромосом.) Дані зонди використовуються для ідентифікації наявної короткої (неповторюваної) послідовності виділеної ДНК, яка використовується для приготування міченого зонда набором хромосом. Вони призначені для виявлення діагностично та прогностично значущих хромосомних аберацій при різних патологічних станах (моносомії та трисомії за окремими хромосомами). Найбільш широке поширення цих проб отримано пренатальной цитогенетичної діагностиці, особливо у дослідженнях клітин хоріальної тканини, інтерфазних ядер амніоцитів.

2. ДНК - проби до тіломірних ділянок хромосом (TEL telomericprobe) призначені для виявлення делецій та перебудов, що зачіпають кінцеві ділянки плечей хромосом. Такі зонди специфічні для р- або q-пліч хромосом та комплементарні ділянці довжиною близько 300 т. п. н. від кінця хромосоми. Як правило, ДНК - зонди для коротких і довгих плечей хромосом пов'язані з різними флуорохромами, що дозволяє виявляти на одному цитогенетичному препараті обидва тіломірні ділянки хромосоми.

3. центромірні зонди-повтори, альфоїдні або хромосомні нуменатори (CEP – centromere. Enumeration. Probe) – це хромосомо-специфічні ДНК-проби, представлені послідовностями тандемних альфа- та бета-сателітних повторів. Ці повтори розташовуються переважно у центромірних чи прицентромірних гетерохроматинових ділянках хромосом. З їх допомогою кожна хромосома може бути пофарбована в різний колір, що дозволяє швидко визначити число хромосом і відхилення від нормального їх числа; 4. зонди на всю хромосому, цільно-хромосомний зонд комплементарних до окремих ділянок хромосоми, але в цілому покривають її довжину. Використовуючи бібліотеку таких зондів, можна "розфарбувати" всю хромосому і отримати диференціальний спектральний каріотип індивіда. Даний тип аналізу застосовується для аналізу хромосомних аберацій, наприклад, транслокацій, коли шматочок однієї хромосоми переноситься на плече іншої.

Області застосування FISH широко використовується для вирішення наступних клінікодіагностичних завдань: 1. Перимплантаційна пренатальна та діагностика хромосомних аномалій. Використовується в клініках екстракорпорального запліднення (ЕКО) та перинатальних центрах. Дозволяє своєчасно (до імплантації ембріона у разі ЕКЗ або на ранніх стадіях розвитку плода) виявити генетичні порушення у майбутньої дитини та вжити необхідних заходів. 2. Онкогематологія. Онкогематологічні захворювання виникають у результаті різних хромосомних абеберацій, тому для їхньої діагностики використовують відповідні CEP та LSI зонди. 3. Діагностика солідних пухлин. В даний час встановлюється все більше причинно-наслідкових зв'язків між розвитком конкретних онкологічних захворювань та специфічних для них змін у геномі. Тому при використанні відповідних ДНКзондів можна проводити онкологічну FISH-діагностику.

Інтерфазнаяцитогенетика: Комбінація FISH з іншими методами: імунофенотипування FISH (FICTION); + FICTION (Fluorescence Immunophenotyping and Interfase Cytogenetics, як Tool for Investigation Of Neoplasms) – для дослідження пухлинних клітин. Для цього аналізу використовують незабарвлені мазки крові, кісткового мозку чи препарати інших тканин. 1 етап - препарати інкубують зі специфічними моноклональними антитілами, 2 етап - проводять кон'югацію з флуорофорами для подальшої візуалізації комплексу антиген-моноклональне антитіло. 3 етап - здійснюють гібридизацію in situ із ДНК-зондами. Для виявлення моноклональних антитіл та ДНК-зондів використовують флуорофори, що розрізняються за кольором. Вивчення препарату під флуоресцентним мікроскопом за наявності необхідного набору фільтрів дозволяє одночасно проводити аналіз імунофенотипу гібридизаційних та сигналів в інтерфазних ядрах.

Chromosomaldeletionof TNFAIP 3 в с. HL вирізняєтьсяза interfasecytogenetics. FICTION analyses of. representative с. HL cases combining. CD 30 expresion(red) and FISH probes для TNFAIP 3 and chromosome 6 centromere (blue [b]). У двоу-color assays в A–C and E and F, TNFAIP 3 probe is labeled in green (g); у трикутному кольорі застосовується в D, TNFAIP 3 probe gives a g/orange colocalized (co) сигнал. Дві різні стратегії є використані для розповсюдження двох-і трикутних кольорів FISH assays in combination with CD 30 immunofluorescence; i. e. , двобарвисті assays (A-C and E and F) є виконані за допомогою трикутного кольору дисплея, де false multicolor дисплей буде охоплений Isis software is applied for the triple-color assay (D) to simultaneously show four colors ( ie , CD 30 [r], TNFAIP 3 [g] and orange, and chromosome 6 centromere [b]).

Цифровий запис мікрозображень відкрив можливість переведення в псевдоцвіту не тільки комбінації флуорофорів, а й співвідношення їх, інтенсивностей

Багатобарвне фарбування хромосом (Muli. Color Banding - МСВ) Даний метод призначений не для повного аналізу всіх хромосом, а для детального аналізу окремої хромосоми. Локус-специфічні ДНК-зонди мітять різними флуорофорами або комбінаціями флуорофорів так, що рівень сигналу кожного із ДНК-зондів варіює за інтенсивністю. Перекриття профілів інтенсивності сигналів ДНК-зондів забезпечує варіації співвідношень інтенсивностей флуоресценцій різних флуорофорів вздовж хромосоми. Відносини інтенсивностей можуть бути переведені в псевдоцвіт, і, таким чином, кожній точці зображення, а, отже, кожному з хромосомних локусів, відповідатиме свій псевдоцвіт. Даний варіант багатобарвного FISH-метода виявився високоефективним при аналізі не тільки міжхромосомних, а й внутрішньохромосомних перебудов при онкологічних захворюваннях. Однак для його успішного застосування необхідно попередньо визначити хромосому, яка буде досліджена. Цей метод молекулярної цитогенетики підходить для аналізу порушень каріотипу, асоційованих з певними хромосомами.

До теперішнього часу створені набори ДНК-зондів, що забезпечують проведення МСВ для всіх хромосом людини. на хромосомі 5; багатобарвний бендинг хромосоми 5; ідіограма хромосоми 5; флуорохроми, використані для МСВ).

Метафазна цитогенетика, що історично виникла раніше за інтерфазну, дозволяє визначати широкий спектр хромосомних порушень, але для цього необхідно, щоб досліджувані клітини знаходилися на стадії метафази мейозу.

Багатобарвне каріотипування Аналіз здійснюється при використанні ДНК зондів суцільного фарбування до плечей або цілих хромосом (зонди WCP - whole chromosome paint). Такі зонди гібридизуються з короткими послідовностями ДНК, розташованими по всій довжині хромосоми. Таким чином, при вивченні під флуоресцентним мікроскопом хромосома виглядає рівномірно забарвленою певний колір.

ДНК - зонди, що використовуються для такого аналізу, складаються із суміші зондів суцільного фарбування для повного набору хромосом людини, помічених за допомогою комбінації з декількох флуорохромів, співвідношення яких підібрано індивідуально для кожної пари хромосом. Використання відповідних методів реєстрації та комп'ютерних програм аналізу зображення, що оцінюють інтенсивність світіння всіх флуорохромів для кожної точки зображення, дозволяє провести каріотипування, при якому кожна пара хромосом має свій унікальний "псевдоцвіт".

M-FISH (multitarget multifluor multicolorабо multiplex. FISH) є загальною назвою для традиційних багатобарвних FISH, що використовують комплекти флуорохром-специфічних фільтрів. Принцип M-FISH полягає в роздільній цифровій реєстрації сигналу всіх флуорохромів, що досягається послідовною зміною комплектів фільтрів. Всі зображення записуються в окремі файли, що дозволяє проводити ефективну обробку, пов'язану з поділом сигналу і фону, а також кількісною оцінкою сигналу. Обробка всієї записаної інформації за допомогою спеціального програмного забезпечення переводить інформацію про рівень сигналів флуорохромів у кожній точці зображення псевдоцвіту. Одним з основних обмежень числа використовуваних ДНК-зондів є число доступних флуорохромів, з спектрами збудження і емісії, що не перекриваються, і наявність відповідних комплектів фільтрів.

24-колірна FISH Найбільш широко M-FISH використовується як 24-колірна FISH для одночасної ідентифікації матеріалу всіх хромосом людини. Вона має високу ефективність при детекції хромосомних транслокацій, але не призначена для виявлення делецій та інверсій. Однак, ця проблема може бути частково вирішена одночасним забарвленням DAPI хромосом, що дає можливість проведення аналізу диференціальної смугастість хромосом, хромосомна приналежність матеріалу яких вже ідентифікована. На жаль, необхідно помітити, що якість DAPI-бендингу хромосом після M-FISH істотно поступається GTG диференційного забарвлення і навіть DAPI-бендингу після звичайної гібридизації in situ.

Rx. FISH Принцип M-FISH був використаний для створення багатобарвного бару коду хромосом людини і методу багатобарвного бендингахромосом, заснованого на міжвидовій in situ гібридизації. На відміну від 24 кольорової FISH цей метод дозволяє безпосередньо виявляти частину внутрішньохромосомних перебудов. ДНК зонди, що використовуються в Rх. FISH, позначені комбінацією, 3-х флуорохромів, що забезпечує 7 псевдоцвітів. Вони специфічно фарбують окремі райони хромосом, створюючи їхню кольорову смугастість. Така особливість ДНК спроб для Rх. FISH обумовлена ​​способом їхнього отримання. Вони є хромосом специфічні ДНК бібліотеки двох видів гиббонов: Hylobates concolor і Hylobates syndactylus.

В результаті інтенсивних хромосомних перебудов, що мали місце при формуванні сучасних видів гібонів, матеріал їх хромосом виявився сильно перетасованим у порівнянні з організацією хромосом у людини, хромосоми якої відомі своїм консерватизмом. Ставлення хромосоми 1 людини до хромосом гібонів наведено малюнку 1,

на малюнку 2 наведено загальний вигляд хромосом людини, отриманий в результаті Rх. FISH. а) Метафазна пластинка; б) Розкладка хромосом.

Однак RXFISH має досить серйозні обмеження - перебудови хромосом, що мали місце всередині одного кольорового RX-бенду не можуть бути виявлені за допомогою цього методу, якщо вони не призводять до значних та легко видимих ​​змін розміру цього бенду. - зонди фарбують кілька хромосомних районів різних хромосом в один псевдоцвіт. Тим не менш, при збільшенні числа використовуваних флуорохромів безсумнівно, метод RXFISH буде більш інформативним, ніж рутинна 24-колірна FISH.

До переваг RXFISH в даний час слід віднести наступні пункти: Метод дозволяє здійснювати аналіз всього геному людини в одному експерименті багатобарвної FISH. Є комерційно доступні набори мічених ДНК проб і необхідних систем детекції. Метод дозволяє проводити швидку ідентифікацію значної частини всередині та міжхромосомних перебудов. Можлива автоматична ідентифікація метафазних хромосом кольорового бендингу. Для кожної хромосоми людини є унікальний колірний бар код. RXFISH інтегрований у робочу станцію Cyto. Vision та стандартні системи флуоресцентної мікроскопії.

Спекральне каріотипування (SKY-spectralkaryotyping) Основні принципи аналізу мікроскопічних зображень при спектральному каріотипу практично не відрізняються від використовуваних при M-FISH. Відмінності пов'язані зі способом реєстрації зображення. Технологія SKY дозволяє в ході одного вимірювання отримувати спектральні криві для всіх точок зображення, незалежно чи це пов'язано з епіфлуоресценцією або з традиційною світловою мікроскопією. Для спектрального каріотипування всіх хромосом людини використовують п'ять флуорохромів один у зеленому спектрі: два в червоному і два в інфрачервоному. Порушення та емісія всіх флуорохромів, що використовуються при міченні ДНК зондів, проходить при одному комплекті фільтрів, що дозволяє уникнути їх послідовної зміни, проміжних фокусувань, а, отже, і пов'язаних з ними проблем, таких як просторове зсув зображення, визначення порогових значень та сегментаційних масок . На підставі аналізу спектральних кривих визначається наявність або відсутність у даній точці конкретних флуорохромів.

Наступним кроком є ​​процедура класифікації, яка дозволяє прямо та однозначно визначати хромосомну приналежність аналізованого матеріалу. Це забезпечує надійну ідентифікацію (з точністю до хромосоми) матеріалу маркерних хромосом, а також дериватів хромосом, що є наслідком різноманітних перебудов. Великою перевагою SKY є те, що паралельно спектральному іміджу реєструється фарбування DAPI. Програмне покращення DAPI бендингу дозволяє досягти диференціальної смугастість за якістю близькою до GTG-бендингу. Можливість паралельного аналізу спектрального іміджу та якісного диференціального забарвлення хромосом значно спрощує інтерпретацію результатів SKY та дозволяє більш точно визначати точки хромосомних розривів. До безперечних переваг SKY відноситься можливість використання флуорохромів з перекриваються спектрами збудження та емісії, що значно розширює список придатних до використання флуорохромів, а також збільшує число флуорохромів, які можуть бути використані одночасно. Включення до списку нового флуорохрому не вимагає придбання нового комплекту фільтрів, тому що для проведення SKY достатньо одного блоку фільтрів для спектральної FISH та одного блоку фільтрів для DAPI.

До недоліків SKY можна віднести: - тривалий час експонування, необхідний запису мікроскопічних зображень. - SKY є дещо менш ефективним ніж М-FISH, у разі необхідності проведення досліджень із відносно невеликими за розміром ДНК-зондами.

Каріотипування зміною кольору (ССК Color changing karyotyping) Цей метод заснований на аналізі відмінності в довжині сигналу між зразками ДНК, гібридизованими з ДНК - зондами, пов'язаними з флуорохромами, і з ДНК - зондами, що несуть антитіла. Метод здійснимо за наявності всього 3 фільтрів і не вимагає спеціальних камер та програмного забезпечення. Для ідентифікації хромосом проводять одну гібридизацію та отримують два зображення. В основі методу лежить відмінність у довжині флуоресцентного сигналу, оскільки час експозиції проб ДНК, пов'язаних з антитілами, на 80 - 90% менше, ніж проб, пов'язаних із флуорохромами. Після реакції гібридизації мазки експонують із відповідними первинними антитілами, а потім проводять візуалізацію, отримуючи перший знімок. Потім препарати експонують з вторинними антитілами та авідином, пов'язаними з тими самими флуорохромами. Мазки можна контрофарбувати, використовуючи DAPI.

Надалі знову одержують знімки препаратів, використовуючи по черзі 3 фільтри. Ці зображення зіставляють, використовуючи спеціальне програмне забезпечення, і отримують другий знімок, на якому буде видно тільки хромосоми, пов'язані з певними антитілами. Таким чином, деякі хромосоми будуть флуоресціювати лише на першому або другому знімку, тоді як інші змінюватимуть свій колір на різних знімках.

Порівняльна геномна гібридизація (CGH) Метод було створено виявлення кількісних порушень в геномі. Він заснований на проведенні реакції гібридизації in situ з використанням як ДНК - зонда всього геному. Виділену та нормальну донорську ДНК мітять флуорохромами різного кольору, перетворюючи їх таким чином на ДНК зонди. Еквівалентні кількості цих зондів змішують та використовують при гібридизації з контрольним цитогенетичним препаратом. Після проведення FISH метафази аналізують на флуоресцентному мікроскопі, визначаючи за допомогою спеціалізованої програми комп'ютерного аналізу зображення інтенсивність флуоресценції двох флуорохром по всій довжині кожної хромосоми.

За відсутності кількісних змін у каріотипі досліджуваного зразка спостерігатиметься певне співвідношення інтенсивності світіння двох флуорохромів. У разі ампліфікації генів інтенсивність сигналу відповідного флуорохрому посилюватиметься, а у разі втрати частини генетичного матеріалу, навпаки, – слабшатиме. Таким чином, CGH дозволяє виявити геномний дисбаланс, але цей метод не можна використовувати для виявлення збалансованих транслокацій та інверсій, а трисомії та делеції можна визначити лише у тому випадку, якщо розмір незбалансованої ділянки становить не менше 10 млн пар нуклеотидів.

Хромосомний дисбаланс у досліджуваному зразку оцінюють за різницею інтенсивності флуоресценції двох різних флуорохромів за допомогою обчислення флуоресцентного відношення (ФО).

Метод CGH має ряд переваг у порівнянні з іншими методами аналізу змін геному: По-перше, він не залежить від джерела досліджуваного матеріалу, і може бути успішно проведений з малою кількістю ДНК, що тестується, включаючи архівний матеріал. По-друге, він дозволяє отримати детальну інформацію про втрати або збільшення кількості копій генетичного матеріалу по всьому геному в одному експерименті. По-третє, метод CGH не вимагає приготування метафазних препаратів хромосом з досліджуваної тканини, тобто не залежить від процесу культивування клітин і пов'язаних з ним артефактів.

Геномна гібридизація situ (genomicin situ hybridization in, GISH) – варіант методу гібридизації situ, що полягає в тому, що для гібридизації з фіксованими зразками як флуоресцентно мічений зонд використовується сумарна геномна ДНК одного виду організму, з якою конкурує сумарна геномна ДНК іншого виду організму; використовується для визначення міжвидових та внутрішньовидових відмінностей геномів, хромосомних перебудов, делеції та заміщень.

Варіації FISH 1) Q-FISH - quantitative FISH: Розроблений Lansdorp та ін. 1998. Short telomeres on human chromosome 17 p. Nat. Genet. 18: 76-80. Кількісний метод. Розроблено для роботи з проточною цитометрією. Спочатку застосовувався для вимірювання довжини хромосом (роздільна здатність: 200 bp) шляхом підрахунку числа тіломерних повторів. Використовуються PNA-кон'юговані зонди. Спочатку досліджували метафазні хромосоми (власне QFISH), тепер даний метод застосовний і для інтерфазних хромосом (IQ-FISH). Q-FISH проводиться на культурі клітин, зрізах тканин (обидва на склі). На даний момент Q-FISH є важливим інструментом у вивченні ролі теломерів у процесах старіння та ракоутворення.

PNA-FISH – Peptide nucleic acids FISH: Пептидні нуклеїнові кислоти (PNAs) – синтетичні аналоги ДНК, в якому цукровий кістяк фосфату дезоксирибози, що підтримує азотисту основу, замінений на незаряджений пептидний кістяк. Внаслідок такої структури: при гібридизації PNA-олігомерного зонда з комплементарною ДНК/РНК не відбувається електростатичного відштовхування. PNA-DNA (PNA-RNA) дуплекси набагато стабільніші за натуральні гомо/гетеродуплекси. Висока специфічність зв'язування PNA-DNA: PNA-DNA гібридизація набагато чутливіша щодо невідповідності пар основ, ніж DNA-DNA гібридизація. Так, за допомогою PNA-зонда можна розрізнити два центромірні повтори, що розрізняються всього по одній парі основ. PNA має відносну гідрофобність (у порівнянні з DNA), внаслідок чого PNA краще дифундує крізь клітинні стінки => широке застосування в мікробіології. На підставі високої специфічності зв'язування: вважається, що PNA технологія незабаром стане основою для створення аллель-специфічних зондів для гібридизації in situ. Застосовується у генетиці, цитогенетиці, епігенетиці, мікробіології та ін.

3) Flow-FISH – FISH for flow cytometry: Запропонований в 1998 р.: Rufer, N., Dragowska, W., Thornbury, G., Roosnek, E. & Lansdorp, PM cytometry. Nature Biotechnol. 16, 743-747 (1998). Комбінація Q-FISH та проточної цитометрії, що дозволяє аналізувати (вимірювати) сигнал та сортувати. Для flow-FISH використовується клітинна суспензія (для вимірювання довжини теломерів хромосом), хромосомні спреди та виділені хромосоми (для подальшого картування). Як і в Q-FISH, використовуються PNA-мічені тіломірні зонди (наприклад, для візуалізації та вимірювання довжини теломірних повторів) Головна перевага – швидший метод (аналіз/сортування великої кількості клітин/хромосом). Широко застосовується дослідження різних проблем: старіння, збереження теломер, дослідження суспензій гемотопоетических стовбурових клітин ex vivo, дослідження бактерій.

Багатопарамерні аналізи можуть бути різними для типів типів з одним виразом, за допомогою внутрішнього контролю, і аналізу з leukocyte subtypes.

Переваги flow-FISH: Легко відтворюваний результат Можливість аналізувати підгрупи клітин у популяції використовуючи фізичні імунофлюоресцентні та маркери Краща продуктивність, ніж у Q-FISH Можливість отримувати кількісні дані щодо флюоресценції тисяч клітин.

ДОСЛІДЖЕННЯ ВИДІЛЕНИХ ХРОМОСОМ за допомогою методів проточної цитометрії 1. Сортування хромосом за допомогою проточної цитометрії - Каріотипування за допомогою проточної цитометрії використовується для подальшого картування генів та побудови хромосомних бібліотек. - Ідентифікація та локалізація генів на сортованих хромосомах проводиться з подальшим застосуванням методів FISH/методу PRINS (primed in situ labeling) або його варіацій та хромосом-специфічної ПЛР. - До 2011 р. успішно сортовані поки що лише хромосоми 17 видів культивованих рослин. - Сортування метафазних або викрадених хромосом з високим індексом поділу.

Флуоресцентна мітка: - Хромосоми мітяться флуорохромами, специфічними до нуклеїнових кислот. - флюорохроми вибираються відповідно 1) зі специфічністю до азотистих основ, 2) з умовами експерименту (у тому числі враховуючи довжини хвиль наявних лазерів). 1. Для моноваріантного аналізу використовують фарби, не специфічні до AT або GC парам: propidium iodide : 300 і 520 нм, емісії: 600 нм, необхідний лазер: 488 нм-аргоновий лазер або лампа + long-pass filter. 2. Для біваріантного аналізу використовують: chromomycin (специфічний для G-C пар основ), пік A 3 збудження: 458 нм, емісії 580 нм. Лазер: , 458 нм мінімум 400 м. В потужність. Hoechst 33258 (специфічний для A-T пар основ), збудження: 351 -364 нм, емісія: 470 нм. Лазер: 351-364 нм (потужний). Лазери повинні бути розділені в часі та просторі через часткове перекриття спектрів флюорохромів.

2. Дослідження хромосом/нуклеотидних послідовностей після сортування (для побудови фізичних та генетичних карт тощо) FISH BAC-FISH PRINS C-PRINS Дослідження великих геномів з довгими хромосомами. Картування послідовностей з великою кількістю повторів (пр: тіломірних та центромірних ділянок). Використання коротких зондів. Завдяки великій кількості повторів сильний сигнал. Стандартна величина зонда: 15 – 30 нуклеотидів. FISH

Проблеми FISH: Складно локалізувати однолокусні послідовності ДНК (тобто унікальні послідовності ДНК, що не повторюються), тому що при використанні стандартних коротких зондів сигнал буде дуже слабким. Збільшення довжини зонда до кількох кілобаз для посилення сигналу призведе до зниження чутливості і => до неспецифічного зв'язування. Рішення: BAC-FISH -BAC-FISH – комбінація методу FISH та використання клонів геномної ДНК, вбудованої в бактеріальні штучні хромосоми (BAC), що дозволяють вбудовувати великі послідовності ДНК. -Ефективний метод для ідентифікації та картування окремих хромосом організмів з невеликими геномами. Як зонд використовується BAC-зонди, overgos (overlapping oligonucleotides).

Альтернатива FISH: PRINS PRINS (primed in situ labeling) – спосіб мічення хромосом за допомогою відпалу олігонуклеотидного ДНК-праймера з гомологічною послідовністю денатурованої хромосомної ДНК та подальшого подовження ензиматичного праймера in situ міченими нуклеотидами. Вперше описано Koch та ін. в 1989 р. (Koch, JE, Kølvraa, S., Petersen, KB, Gregersen, N., and Bolund, I. (1989)). , 259-265). PRINS є альтернативою FISH. Застосовується для локалізації нуклеотидних послідовностей, розпізнавання та підрахунку метафазних або інтерфазних хромосом або хромосомних пар (в т. ч. хромосомної анеуплоїдії). відпал неміченого праймера (праймер – затравка) з досліджуваної ДНК елонгація затравки за допомогою термостабільної ДНК-полімерази та мічених нуклеотидів зупинка реакції (приєднання блокуючої молекули на 3'-кінець) Праймер: фрагмент рестрикції ПЛР-продукт - непряме (biotin/dig флюорохромкон'югований avidin/ anti-dig) - У результати кожної PRINS реакції можна ідентифікувати лише одну пару гомологічних хромосом (одну хромосому). Наступну реакцію PRINS на тому самому склі можна проводити тільки після блокування попередньої. - Застосовується для послідовностей ДНК із великою кількістю повторів.

Переваги PRINS: 1. Потрібна мінімальна інформація про послідовність, необхідна синтезу олигонуклеотидного праймера. 2. Найбільш швидкий і простий метод детекції цікавої для нас послідовності на хромосомі (порівняно з використанням важких зондів для FISH, що гібридизуються дуже великий проміжок часу). 3. Виняток стадії мічення зонда. 4. Можливість елонгувати праймер міченими нуклеотидами для посилення сигналу c-PRINS при детекції коротких унікальних послідовностей. Для виявлення малокопійних повторів або коротких унікальних послідовностей застосовується чутливіший метод – cycling PRINS (c-PRINS). C-PRINS запропонований Gosden та ін. 1991 р., покращений широко використовуваний протокол – Kubaláková et al. , 2001 (Kubaláková M, Vrána J, Cíhalíková J, Lysák MA, Dole J (2001). Localisation of DNA sequences on plant chromosomes using PRINS and C-PRINS. Methods in Cell Science 23: 71 -82). C-PRINS включає серію термальних циклів, аналогічних ПЛР.

Шлях fluid для FISH: -BD Bioscience Standard (GM Baerlocher, I Vulto, G de Jong, PM Lansdorp. Flow cytometry and FISH на рівні середньої частини teloмерів (flow FISH). 2006. Nature Protocols 1, - 236) -40 m. M KCl +10 m. M Na. Cl (Vrána J, Kubaláková M, Simková H, Cíhalíková J, Lysák MA, Dolezel J. Flow sorting of mitotic chromosomes in common wheat (Triticum aestivum L.). Genetics. 2000; 156(4): 2033 -4 . So 4 buffer без дитіотреітола (Lj. Li, L. Ma, K. Arumuganathan, YC Song. Flow-sorted chromosomes: добрий матеріал для рослин гене фізичного mapping. Caryologia. 2006, vol. 59, № 2: 99 -103) -Autoclaved 0. 1% (wt/vol) Na. Cl -50м. M Na. Cl. 823 - 829) -Chromosome-stabilizing polyamine buffer (proteín-залізний шар fluid) (Darzynkiewics Z, Robinson JP, Crissman H. Flow Cytometry, 2nd Ed. Part B. San Diego, CA.

Стандартні мікроскопи не дозволяють провести дослідження клітин на молекулярному рівні. Одного потужного збільшення тут недостатньо. Потрібна цифрова обробка зображень, додаткові реагенти та інші матеріали та прилади. Для аналізу ДНК та РНК в даний час використовується метод, який називається гібридизацією In situ. Оскільки він передбачає фарбування зразків з подальшим аналізом випромінювання, його називають флуоресцентною гібридизацією або методом FISH.

Флуоресцентна гібридизація In situ широко застосовується в генетичних дослідженнях, при діагностиці онкологічних захворювань, під час ведення вагітності та багатьох інших галузях науки. В основу методу, як випливає з назви, покладено властивість молекул ДНК та РНК утворювати стійкі зв'язки із зондами, тобто утворювати гібридні молекули. Слова «In situ» означають, що це спостереження проводяться «на місці», тобто безпосередньо без використання додаткового середовища.

ДНК-зонди (проби) комплементарні молекулам у досліджуваному зразку. До їх складу входять нуклеозиди, що позначаються флюорофорами (речовинами, що надають молекулі властивості флуоресценції). Цей метод називається прямим міченням; якщо як маркерів використовуються гібридні молекули-кон'югати, то виходить непряме мечение. При прямому міченні гібридизацію можна спостерігати у флуоресцентний мікроскоп відразу після завершення. Для непрямого мічення проводиться ще одна процедура фарбування. Вона відокремлює за кольором молекули-кон'югати від досліджуваних зразків.

Спосіб гібридизації з непрямим міченням вимагає більше часу і реактивів, проте він дозволяє досягти достовірніших результатів. Рівень сигналу в цьому випадку буде вищим, а крім того, можливе і його ступінчасте посилення. Як зонди для мічення використовуються клоновані послідовності ДНК (продукти ПЛР, геномна ДНК, мічені олігонуклеотиди та інші). Переріз зондів виконується декількома способами. Поширені методи нік-трансляції та полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з міченими нуклеотидами.

Порядок проведення процедури

Метод In situ починається з підготовчого етапу – конструювання зондів. Розміри зондів не повинні бути достатньо великими, щоб заважати процесу дослідження. Занадто малі зонди також небажані, тому що вони не гарантують достовірність результатів. Тому для досліджень беруть зонди розміром до 1 тисячі п.о. Якщо зонд є ДНК із двох ланцюжків, то перед гібридизацією кислоту денатурують. При отриманні бажаного результату (забарвлюються певні ділянки хромосом або всі хромосоми) подальша гібридизація ДНК-проб з повторюваними послідовностями блокується. Для цього до гібридизаційної суміші додаються немічені молекули ДНК повторів.

Наступний етап досліджень – приготування препаратів інтерфазних ядер або метафазних хромосом. Клітини фіксуються у субстраті на склі, після чого виконується денатурація ДНК. Для зниження температури денатурації та збереження морфології ядер та хромосом денатурацію проводять з додаванням формадиду. Після цього до матеріалу додають зонди та виконують гібридизацію протягом декількох годин. Після її завершення проводиться багатоступінчасте відмивання для видалення зондів, що не з'єдналися з молекулами зразків.

Сучасний метод цитогенетичного аналізу, що дозволяє визначати якісні та кількісні зміни хромосом (у тому числі транслокації та мікроделеції) та використовуваний для диференціальної діагностики злоякісних захворювань крові та солідних пухлин.

Синоніми російські

Флуоресцентна гібридизація in situ

FISH-аналіз

Синоніми англійські

Fluorescence in-situ hybridization

Метод дослідження

Флуоресцентна гібридизація in situ.

Який біоматеріал можна використати для дослідження?

Зразок тканини, зразок тканини у парафіновому блоці.

Як правильно підготуватися до дослідження?

Підготовка не потрібна.

Загальна інформація про дослідження

Флуоресцентна гібридизація in situ (FISH, від англ. fluorescence in- situ hybridization) – це один із найсучасніших методів діагностики хромосомних аномалій. Він заснований на використанні ДНК-проб, мічених флуоресцентною міткою. ДНК-проби є спеціально синтезовані фрагменти ДНК, послідовність яких комплементарна послідовності ДНК досліджуваних аберантних хромосом. Таким чином, ДНК-проби розрізняються за складом: визначення різних хромосомних аномалій використовуються різні, специфічні ДНК-проби. ДНК-проби також різняться за розміром: одні можуть бути спрямовані до цілої хромосоми, інші – конкретного локусу.

В ході процесу гібридизації за наявності в досліджуваному зразку аберантних хромосом відбувається їх зв'язування з ДНК-пробою, яке при дослідженні за допомогою флуоресцентного мікроскопа визначається як флуоресцентний сигнал (позитивний результат тесту FISH). За відсутності аберантних хромосом незв'язані ДНК-проби в ході реакції "відмиваються", що при дослідженні за допомогою флуоресцентного мікроскопа визначається як відсутність флуоресцентного сигналу (негативний результат тесту FISH). Метод дозволяє оцінити як наявність флуоресцентного сигналу, а й його інтенсивність і локалізацію. Таким чином, FISH-тест – це не лише якісний, а й кількісний метод.

FISH-тест має низку переваг у порівнянні з іншими методами цитогенетики. Насамперед дослідження FISH може бути застосоване як до метафазних, так і до інтерфазних ядрів, тобто до клітин, що не діляться. Це основна перевага FISH у порівнянні з класичними способами каріотипування (наприклад, фарбуванням хромосом по Романівському-Гімзі), які застосовуються лише до метафазних ядр. Завдяки цьому дослідження FISH є точнішим методом для визначення хромосомних аномалій у тканинах з низькою проліферативною активністю, у тому числі у солідних пухлинах.

Так як у FISH-тесті використовується стабільна ДНК інтерфазних ядер, для дослідження можуть бути використані найрізноманітніші біоматеріали - аспірати тонкокутної аспіраційної біопсії, мазки, аспірати кісткового мозку, біоптати і, що важливо, збережені фрагменти тканини, наприклад, гістологічні блоки. Так, наприклад, FISH-тест може бути успішно виконаний на повторних препаратах, отриманих з гістологічного блоку біоптату молочної залози при підтвердженні діагнозу "аденокарцинома молочної залози" і необхідності визначення HER2/neu-статусу пухлини. Слід особливо наголосити, що на даний момент дослідження FISH рекомендовано як підтверджуючий тест при отриманні невизначеного результату імуногістохімічного дослідження пухлини на онкомаркер HER2/neu(ІГХ 2+).

Іншою перевагою FISH є його здатність визначати мікроделеції, які не виявляються за допомогою класичного каріотипування або ПЛР. Це має особливе значення при підозрі на синдром Ді Джорджі та велокардіофаціальний синдром.

FISH-тест широко використовується у диференціальній діагностиці злоякісних захворювань, насамперед у онкогематології. Хромосомні аномалії у поєднанні з клінічною картиною та даними імуногістохімічного дослідження є основою класифікації, визначення тактики лікування та прогнозу лімфо- та мієлопроліферативних захворювань. Класичними прикладами є хронічний мієлолейкоз – t (9; 22), гострий промієлоцитарний лейкоз – t (15; 17), хронічний лімфолейкоз – трисомія 12 та інші. Що стосується солідних пухлин, найчастіше FISH-дослідження застосовується при діагностиці раку молочної залози, сечового міхура, товстої кишки, нейробластоми, ретинобластоми та інших.

Дослідження FISH також може бути використане у пренатальній та преімплантаційній діагностиці.

FISH-тест часто проводять у поєднанні з іншими методами молекулярної та цитогенетичної діагностики. Результат цього дослідження оцінюють у комплексі з результатами додаткових лабораторних та інструментальних даних.

Навіщо використовується дослідження?

• Для диференціальної діагностики злоякісних захворювань (крові та солідних органів).

Коли призначається дослідження?

• При підозрі на наявність злоякісного захворювання крові чи солідних пухлин, тактика лікування та прогноз яких залежить від хромосомного складу пухлинного клону.

Що означає результати?

Позитивний результат:

• Наявність у досліджуваному зразку аберантних хромосом.

Негативний результат:

• Відсутність у досліджуваному зразку аберантних хромосом.

Що може впливати на результат?

• Кількість аберантних хромосом.



• Імуногістохімічне дослідження клінічного матеріалу (з використанням 1 антитіла)
• Імуногістохімічне дослідження клінічного матеріалу (з використанням 4 і більше антитіл)
• Визначення HER2 статусу пухлини методом FISH
• Визначення HER2 статусу пухлини методом СISH

Хто призначає дослідження?

Онколог, педіатр, акушер-гінеколог, лікар-генетик.

Література

• Wan TS, Ma ES. Molecular cytogenetics: an indispensable tool for cancer diagnosis. Anticancer Res. 2005 Jul-Aug;25(4):2979-83.
• Kolialexi A, Tsangaris GT, Kitsiou S, Kanavakis E, Mavrou A. Impact of cytogenetic and molecular cytogenetic studies on hematologic malignancies. Chang Gung Med J. 2012 Mar-Apr; 35 (2): 96-110.
• Mühlmann M. Molecular cytogenetics в metaphase and interphase cells for cancer and genetic research, diagnosis and prognosis. Application in tissue sections and cell suspensions. Genet Mol Res. 2002 Jun 30;1(2):117-27.