Metoda de hibridizare fluorescentă in situ (FISH) în diagnosticul bolilor cromozomiale. Hibridarea fluorescentă Hibridarea fluorescentă

Hibridizarea fluorescență in situ, sau metoda FISH (hibridizare fluorescență in situ - FISH), este o metodă citogenetică care este utilizată pentru a detecta și determina poziția unei secvențe specifice de ADN pe cromozomii de metafază sau în nucleele de interfază in situ. În plus, FISH este utilizat pentru a detecta mARN-uri specifice într-o probă de țesut. În acest din urmă caz, metoda FISH face posibilă stabilirea caracteristicilor spațio-temporale ale expresiei genelor în celule și țesuturi.
Metoda FISH este utilizată în diagnosticul genetic preimplantare, prenatal și postnatal, în diagnosticul bolilor oncologice, în dozimetria biologică retrospectivă.

Concepte înrudite

Micronucleu - în citologie, un fragment al nucleului dintr-o celulă eucariotă care nu conține genomul complet necesar supraviețuirii sale. Este o structură patologică și poate fi observată în celulele oricărui țesut. De obicei, micronucleii se formează ca rezultat al diviziunii celulare anormale sau al fragmentării nucleare în timpul apoptozei.

Recombinarea omologă sau recombinarea generală este un tip de recombinare genetică în timpul căruia secvențele de nucleotide sunt schimbate între doi cromozomi similari sau identici. Aceasta este metoda cea mai utilizată de celule pentru a repara daunele ADN-ului dublu sau monocatenar. Recombinarea omologă creează, de asemenea, o varietate de combinații de gene în timpul meiozei, oferind un nivel ridicat de variabilitate ereditară, care, la rândul său, permite populației să se adapteze mai bine...

Cosmide (Cosmides) - plasmide care conțin un fragment de ADN al fagului lambda, inclusiv cos-site. Împreună cu sistemele de ambalare în particule de fagi in vitro, acestea sunt utilizate ca molecule vectoriale pentru clonarea genelor și în construcția de biblioteci genomice. Cosmidele au fost construite pentru prima dată de Collins și Brüning în 1978. Numele lor provine de la o abreviere a doi termeni: cos-section (termenul în sine, la rândul său, provine din engleza cohesive ends - sticky ends) și plasmidă.

Datorită acumulării unei cantități uriașe de informații despre secvențele genelor, în prezent, metodele de genetică inversă sunt adesea folosite pentru a identifica funcțiile genelor. Cercetătorii manipulează secvențele de gene, schimbând sau dezactivând o anumită genă și analizează la ce schimbări duce aceasta. Aceasta este calea geneticii inverse: de la genă la trăsătură/fenotip. Genetica directă și inversă nu sunt abordări care se exclud reciproc, ci se completează reciproc în studiul funcției genelor.
(ing. transformare) - procesul de absorbție de către o celulă bacteriană a unei molecule de ADN din mediul extern. Pentru a fi capabilă de transformare, o celulă trebuie să fie competentă, adică moleculele de ADN trebuie să poată pătrunde în ea prin membranele celulare. Transformarea este utilizată în mod activ în biologia moleculară și ingineria genetică.

Îmbinarea finală non-omologă sau îmbinarea finală non-omologă (NHEJ) este una dintre modalitățile de a repara rupturile duble catenare în ADN. Acest proces este numit non-omolog deoarece capetele deteriorate ale lanțului sunt conectate direct printr-o ligază, fără a fi nevoie de un șablon omolog, spre deosebire de procesul de recombinare omoloagă. Termenul de „unire la capăt neomolog” a fost propus în 1996 de Moore și Haber. NHEJ este semnificativ mai puțin precis decât recombinarea omoloagă...

Cullinii sunt o familie de proteine hidrofobe care servesc drept schelă pentru ligazele ubiquitinului (E3). Toate eucariotele par să aibă cullins. Ele, în combinație cu proteinele RING, formează ligaze culin-RING ubiquitin (CRL), care sunt foarte diverse și joacă un rol în multe procese celulare, de exemplu, proteoliză (distrug aproximativ 20% din proteinele celulare), reglarea epigenetică și imunitatea plantelor mediată de acidul salicilic.

Secvențierea de generație următoare (NGS) este o tehnică pentru determinarea secvenței de nucleotide a ADN-ului și ARN-ului pentru a obține o descriere formală a structurii sale primare. Tehnologia metodelor de secvențiere de generație următoare (NGS) vă permite să „citiți” mai multe secțiuni ale genomului simultan, care este principala diferență față de metodele de secvențiere anterioare. SNP se realizează folosind cicluri repetate de alungire a lanțului indusă de polimerază sau multiple...

Quantiferon (uneori quantiferon, quantiferon test; engleză QuantiFERON) este denumirea comercială pentru un test de diagnosticare imunoenzimatică pentru infecția tuberculoasă, produs de compania americană QIAGEN. Textul folosește tehnologia ELISA pentru a detecta răspunsul imun interferon gamma.

metoda de hibridizare in situ* (în loc, lat.) se bazează pe capacitatea ADN-ului sau ARN-ului de a forma molecule hibride stabile cu sonde ADN/ARN direct pe preparate de cromozomi fixați și nuclee de interfază. Folosind această metodă, puteți determina locația exactă a aproape oricărei secvențe de ADN sau ARN direct în celulă, nucleul celulei sau cromozomi.

Pentru hibridizare. in situ preparate citologice sau histologice adecvate ale celulelor oricăror țesuturi sau organe, preparate conform metodelor standard. Într-un laborator de citogenetică clinică se folosesc preparate din limfocite din sângele periferic cultivate, celule citotrofoblaste epiteliale coriale, celule cultivate și necultivate ale lichidului amniotic, diverse țesuturi din material de avort, precum și frotiuri de epiteliu bucal și celule sanguine.

metoda de hibridizare in situ are o importanță deosebită pentru citogenetica practică datorită dezvoltării unei variante non-izotopice bazată pe utilizarea sondelor marcate cu nucleotide modificate neradioactive. Variantele non-izotopice de hibridizare pe preparate (în special cele fluorescente) au o serie de avantaje în comparație cu cele izotopice: rezoluție mare, care este egală cu rezoluția unui microscop (0,1 - 0,2 μm), nu este nevoie de prelucrarea statistică a rezultatelor, rapiditate și siguranță pentru cercetătorii din domeniul sănătății

În plus, combinația de sonde modificate diferit detectate folosind diferite sisteme de detectare permite determinarea simultană a locației a două sau mai multe secvențe ADN într-o celulă sau pe o placă de metafază. Și utilizarea secvențelor repetitive marcate cu fluorocromi ca sonde ADN reduce timpul de procedură la 7-9 ore (hibridizarea clasică non-izotopică durează două zile, variantele izotopice de la o săptămână la o lună), ceea ce este deosebit de important pentru diagnosticul prenatal. Utilizare Metoda FISHîn diagnosticul citogenetic, permite identificarea rearanjamentelor cromozomiale structurale, stabilirea naturii cromozomilor marker și analizarea încălcărilor numerice ale setului de cromozomi, atât pe cromozomii metafazici, cât și în nucleii interfazici.

Principiul metodei FISH

In nucleu Metoda FISH constă reacția de hibridizare între o sondă de ADN creată artificial și secvența sa de nucleotide complementară a ADN-ului nuclear. Molecula de ADN este formată din două lanțuri de nucleotide elicoidale, iar hibridizarea este posibilă numai dacă lanțurile se separă. Pentru a deconecta lanțurile de nucleotide ale ADN-ului, se folosește denaturarea (pentru hibridizarea ulterioară trebuie denaturate atât ADN-ul din nucleele probei studiate, cât și sonda ADN în sine). După denaturare, sonda ADN hibridizează la secvența sa de nucleotide complementară și poate fi detectată folosind un microscop fluorescent.

Astfel, forma generală a protocolului de stabilire PEŞTE poate fi prezentat sub următoarea formă:

1. Prepararea unui preparat histologic sau citologic.
Pregătirea unui preparat histologic se realizează conform schemei standard: tăiere, marcare, cablare, turnare, microtomie, așezarea tăieturii pe o lamă de sticlă și deparafinizare. La prepararea unui preparat citologic se folosesc soluții speciale de precipitare și centrifugare, ceea ce face posibilă obținerea unei suspensii celulare concentrate.

2. Pretratament (dacă este necesar).
Preparatul este procesat de proteaze pentru a elimina prezența proteinelor care împiedică hibridizarea.

3. Aplicarea unei sonde ADN la preparat și denaturarea ulterioară.
Pentru a denatura sonda și proba de ADN, acestea sunt tratate cu formamidă și încălzite la o temperatură de aproximativ 85-90°C.

4. Hibridarea.
După denaturare, medicamentul este răcit la o anumită temperatură (37°C în cazul studiilor clinice) și incubat într-o cameră umedă timp de câteva ore (durata de incubare este indicată în fiecare protocol specific). În prezent, hibridizatorii automati sunt utilizați pentru denaturare și hibridizare.

5. Spălarea.
Odată ce hibridizarea este completă, sondele nelegate trebuie spălate, ceea ce altfel ar crea un fundal care face dificilă evaluarea rezultatelor FISH. Pentru spălare, se utilizează de obicei o soluție care conține citrat și clorură de sodiu (SSC).

6. Contra-colorare.
Cu ajutorul coloranților fluorescenți (DAPI - 4,6-diamidin-2-fenilindol; iodură de propidiu), tot ADN-ul nuclear este colorat.

7. Analiza rezultatelor folosind un microscop fluorescent. Operațiunile de rutină (deparafinare, pretratare, spălare) pot fi automatizate.

* - Materialul a fost pregătit pe baza informațiilor din surse deschise.

Hibridarea in situ a acizilor nucleici Metoda se bazează pe posibilitatea formării de hibrizi dublu catenar între sonde marcate create artificial pe baza unor secvențe monocatenare (ribo- sau dezoxiribo-, oligo- sau polinucleotide) și secvențe complementare acestora în ținte - molecule de ADN sau ARN analizate. Pentru a identifica situsurile de hibridizare, o sondă ADN (sondă ADN) este marcată cu un grup reporter: ü un izotop radioactiv, ü un fluorocrom, ü o enzimă care dă o colorare sau un produs luminiscent, ü o haptenă cu care se leagă corpul marcat, etc.

Prin detectarea unui hibrid datorită prezenței unui grup reporter în sondă, este posibil - să se estimeze numărul de gene care codifică un anumit tip de ARN, - să se determine proporția de ADN netranscris în genom, - să se stabilească legătura anumitor gene între ele - și locația lor exactă pe cromozomi. Metoda de hibridizare moleculară are sensibilitate mare (o cantitate mică de sondă marcată (10 -15 și 10 -19 M) și, în consecință, poate fi detectată secvența sa complementară în țintă) și viteză de analiză, ceea ce permite utilizarea acestei metode atât pentru cercetare. activități și pentru diagnosticarea bolilor ereditare și infecțioase în medicină, medicina veterinară și producția vegetală.

Apariția noilor tehnologii în citogenetica moleculară, bazate în principal pe hibridizarea in situ a acizilor nucleici, a extins semnificativ posibilitățile de diagnosticare cromozomială.

Citogenetica interfazelor: 1. Banding cromozomi multicolor (MCB). 2. Hibridare fluorescentă in situ (FISH). 3. Combinarea FISH cu alte metode: -citologia + FISH; -histologie + PESTE; -imunofenotipare + PESTE (FICTION); Citogenetica metafază: 1. Colorarea solidă a cromozomilor (Pictura integrală). 2. Hibridarea genomică comparativă (CGH). 3. Cariotiparea cu schimbarea culorii (CCK). 4. Cariotiparea multicoloră: Cariotiparea spectrală (SKY); PESTE multicolor (M - FISH, M - BAND).

FISH - hibridizare fluorescentă in situ - este o metodă citogenetică utilizată pentru detectarea și localizarea secvențelor specifice de ADN pe cromozomi, ARNm, etc. Tehnica se bazează pe hibridizarea unei sonde ADN/ARN marcată fluorescent cu o secvență ADN/ARN complementară. Eticheta este detectată folosind un microscop fluorescent. Metoda FISH a fost introdusă acum peste 30 de ani. A devenit larg răspândită ca metodă de cartografiere fizică a genelor pe cromozomi. Ulterior, a fost aplicat și în alte domenii de cercetare (în domeniile geneticii clinice, medicinei reproducerii, toxicologiei, biologiei evoluționiste, genomicii comparate și celulare și biologiei cromozomiale). În prezent, FISH este folosit în principal pentru a construi hărți fizice și genetice ale cromozomilor, pentru a detecta rearanjamente structurale, translocații, microdeleții, amplificări de gene în cromozomi de interfaza și metafaza. Ca urmare a progreselor în știință (înțelegerea mai bună a proprietăților chimice și fizice ale acizilor nucleici și cromatinei), precum și a dezvoltării microscopiei cu fluorescență și a imaginii digitale, metoda a fost îmbunătățită constant (îmbunătățiri ale sensibilității, specificității, rezoluției) și au fost dezvoltate multe variante ale acestei metode.

1) Celulele sunt aruncate pe o lamă de sticlă determinând răspândirea cromozomilor 4) Cromozomii sunt colorați în contra cu DAPI 2) Sonda marcată fluorescent este plasată pe cromozomi și sigilată. 3) Sonda și cromozomii sunt denaturate, hibridizate apoi spălate 5) Lama este privită la microscop fluorescent

Forma generală a protocolului de constituire a FISH poate fi reprezentată astfel: 1. Prepararea unui preparat histologic sau citologic. Pregătirea unui preparat histologic se realizează conform schemei standard: tăiere, marcare, cablare, turnare, microtomie, așezarea tăieturii pe o lamă de sticlă și deparafinizare. La prepararea unui preparat citologic se folosesc soluții speciale de precipitare și centrifugare, ceea ce face posibilă obținerea unei suspensii celulare concentrate. 2. Pretratament (dacă este necesar). Preparatul este procesat de proteaze pentru a elimina prezența proteinelor care împiedică hibridizarea. 3. Aplicarea unei sonde ADN la preparat și denaturarea ulterioară. Pentru a denatura sonda și proba de ADN, acestea sunt tratate cu formamidă și încălzite la o temperatură de aproximativ 85-900 C.

4. Hibridarea. După denaturare, medicamentul este răcit la o anumită temperatură (370 C în cazul studiilor clinice) și incubat într-o cameră umedă timp de câteva ore (durata de incubare este indicată în fiecare protocol specific). În prezent, hibridizatorii automati sunt utilizați pentru denaturare și hibridizare. 5. Spălarea. Odată ce hibridizarea este completă, sondele nelegate trebuie spălate, ceea ce altfel ar crea un fundal care face dificilă evaluarea rezultatelor FISH. Pentru spălare, se utilizează de obicei o soluție care conține citrat și clorură de sodiu (SSC). 6. Contra-colorare. Cu ajutorul coloranților fluorescenți (DAPI - 4, 6-diamidin-2 fenilindol; iodură de propidiu), se colorează tot ADN-ul nuclear. 7. Analiza rezultatelor folosind un microscop fluorescent Operațiile de rutină (deparafinizare, pretratare, spălare) pot fi automatizate.

Examinarea regiunilor telomerice folosind un microscop fluorescent. Imaginile obtinute in stadiul de interfaza (nucleu) si metafaza (cromozomi individuali) sunt combinate. culoare albastră - DAPI.

Avantajele metodei FISH: 1. Posibilitatea de a studia materialul genetic în nuclee interfazice; 2. Obtinerea rezultatelor obiective pe baza da/nu este o metoda cantitativa 3. Interpretarea relativ simpla a rezultatelor ;rezolutie mare .Dezavantajele metodei FISH : 1. Colorantii fluorescenti se "decoloreaza" rapid ;microscop.

Metoda FISH se bazează pe reacția de hibridizare între o sondă ADN creată folosind tehnologii speciale, care este o secvență de nucleotide de dimensiuni limitate, și o secțiune complementară a ADN-ului nuclear al preparatului citogenetic studiat. Sonda ADN este elementul principal pentru stabilirea FISH și poartă o „etichetă”, adică conține nucleotide care sunt legate direct de un fluorocrom sau o haptenă pentru vizualizare ulterioară de către anticorpi purtători de fluorocrom. ADN-ul marcat nelegat este spălat și apoi sonda de ADN hibridizat este detectată folosind un microscop fluorescent.

Marcarea ADN-ului este împărțită în directă și indirectă. Etichetarea directă introduce elemente reporter în ADN - fluorocromi (rodamină, dietilaminocumarină, roșu Texas etc.). Metoda de etichetare indirectă - o probă de ADN este preconjugată cu liganzi intermediari (biotină, dioxigenină, 2, 4-dinitrofenol), a căror prezență pe un preparat citologic este apoi detectată folosind fluorocromi. În acest caz, sensibilitatea metodei crește foarte mult, deoarece ligandul poate conține mai multe locuri de interacțiune cu fluorocromul. Hibridizarea in situ cu o sondă marcată cu 32 P a fost descrisă pentru prima dată în 1969. Dezvoltarea sistemelor neradioactive pentru marcarea și detectarea sondelor ADN a făcut ca metoda de hibridizare in situ să fie sigură, ușor de realizat și mai puțin laborioasă în procesarea rezultatelor. Coloranții fluorescenți sunt moi și ușor de utilizat, pot fi stocați pe termen nelimitat, oferă o rezoluție ridicată și permit examinarea simultană a mai multor secvențe ADN.

Sonde: sonde marcate primare/secundar ADN/ARN monocatenar/dublu catenar. Sondele sunt marcate: 1) direct: prin inserarea de nucleotide la care este atașat un fluorocrom (PCR sau nick translation) 2) printr-o moleculă reporter (ex: digoxigenină, biotină) la care sunt atașați anticorpi marcați fluorescent. Pentru a îmbunătăți semnalul, puteți utiliza anticorpi secundari, terțiari etc. marcați cu o etichetă fluorescentă. Puncturi ADN ADN Nick Translație ADN polimeraza I adaugă noi nucleotide la 3’ hidroxil ADN polimeraza I elimină bazele individuale de la capătul 5’ Imagistica cromozomală: folosind DAPI (2 mg/ml). 4', 6-diamidino-2-fenilindol; legare puternică la regiunile ADN bogate în AT; excitație cu lumină UV; emisie 461 nm (albastru).

În prezent, există mai multe abordări principale care sunt utilizate pe scară largă de citogenetica moleculară modernă: Identificarea materialului regiunilor cromozomiale extinse și cromozomilor întregi. Detectarea în regiunea de interes a unei secvențe specifice de ADN. Analiza dezechilibrului regiunilor cromozomiale individuale. Pentru a identifica materialul regiunilor cromozomiale extinse și cromozomilor întregi, sondele ADN specifice cromozomilor și regiunii specifice („sonde de pictură”) sunt utilizate pe scară largă.

Caracteristicile diferitelor tipuri de sonde 1. Sonde specifice locului (LSI - locus - identificatori specifici care se leagă de anumite regiuni ale cromozomilor.) Aceste sonde sunt utilizate pentru a identifica secvența scurtă (nerepetabilă) disponibilă a ADN-ului izolat, care este utilizată pentru a pregăti o sondă marcată și hibridizarea ei ulterioară cu un set de cromozomi. Ele sunt concepute pentru a detecta aberațiile cromozomiale semnificative din punct de vedere diagnostic și prognostic în diferite stări patologice (monozomie și trisomie pentru cromozomi individuali). Cea mai răspândită utilizare a acestor probe a fost obținută în diagnosticul citogenetic prenatal, în special în studiile celulelor țesutului corionic și nucleelor de interfaz ale amniocitelor.

2. Sondele ADN către regiunile telomerice ale cromozomilor (TEL telomericprobe) sunt concepute pentru a detecta deleții și rearanjamente care afectează regiunile terminale ale brațelor cromozomilor. Astfel de sonde sunt specifice pentru brațele p sau q ale cromozomilor și sunt complementare unei regiuni de aproximativ 300 kb lungime. de la capătul cromozomului. De regulă, sondele ADN pentru brațele scurte și lungi ale cromozomilor sunt asociate cu diferiți fluorocromi, ceea ce face posibilă detectarea ambelor regiuni telomerice ale cromozomului pe un singur preparat citogenetic.

3. sonde de repetiție centromerelor, numărătoare alfa sau cromozomiale (CEP - centromer. Enumeration. Probe) sunt sonde ADN specifice cromozomilor reprezentate prin secvențe de repetiții satelital tandem alfa și beta. Aceste repetări sunt localizate predominant în regiunile heterocromatine centromerice sau pericentromerice ale cromozomilor. Cu ajutorul lor, fiecare cromozom poate fi vopsit într-o culoare diferită, ceea ce vă permite să determinați rapid numărul de cromozomi și abaterile de la numărul lor normal, complementare secțiunilor individuale ale cromozomului, dar în ansamblu acoperind întreaga sa lungime. Folosind o bibliotecă de astfel de sonde, se poate „colora” întregul cromozom și se poate obține un cariotip spectral diferențial al unui individ. Acest tip de analiză este folosit pentru a analiza aberațiile cromozomiale, cum ar fi translocațiile, atunci când o bucată dintr-un cromozom este transferată pe umărul altuia.

Aplicații FISH este utilizat pe scară largă pentru a rezolva următoarele sarcini clinice de diagnostic: 1. Perimplantare prenatală și diagnosticarea anomaliilor cromozomiale. Folosit în clinicile de fertilizare in vitro (FIV) și centrele perinatale. Permite în timp util (înainte de implantarea embrionului în cazul FIV sau în stadiile incipiente ale dezvoltării fetale) identificarea tulburărilor genetice la fătul și luarea măsurilor necesare. 2. Oncohematologie. Bolile oncohematologice apar ca urmare a diferitelor aberații cromozomiale, prin urmare, pentru diagnosticul lor se folosesc sonde CEP și LSI adecvate. 3. Diagnosticul tumorilor solide. În prezent, se stabilesc din ce în ce mai multe relații cauzale între dezvoltarea unor cancere specifice și modificări specifice ale genomului pentru acestea. Prin urmare, atunci când se utilizează sonde ADN adecvate, este posibil să se efectueze diagnostice oncologice FISH.

Citogenetica interfazelor: Combinarea FISH cu alte metode: - imunofenotiparea FISH (FICTION); + FICTION (Fluorescence Immunophenotyping and Interfase Cytogenetics as a Tool for Investigation Of Neoplasms) - pentru studiul celulelor tumorale. Pentru această analiză, se folosesc frotiuri necolorate de sânge, măduvă osoasă sau preparate din alte țesuturi. Etapa 1 - preparatele sunt incubate cu anticorpi monoclonali specifici, etapa 2 - se realizează conjugarea cu fluorofori pentru vizualizarea ulterioară a complexului antigen-anticorp monoclonal. Etapa 3 - se realizează hibridizarea in situ cu sonde ADN. Fluoroforii care diferă ca culoare sunt utilizați pentru a detecta anticorpi monoclonali și sonde ADN. Studiul preparatului la microscop fluorescent cu setul necesar de filtre permite analiza simultană a imunofenotipului de hibridizare și a semnalelor în nucleele de interfaza.

Cromosomaldeleția TNFAIP 3 în c. HL detectat prin citogenetica de interfaza. analize FICTION de. reprezentant c. Cazurile HL combinate. Expresia CD 30 (roșu) și sonde FISH pentru centromerul TNFAIP 3 și cromozomul 6 (albastru [b]). În testele cu două culori în A-C și E și F, sonda TNFAIP 3 este etichetată cu verde (g); în testul cu trei culori aplicat în D, sonda TNFAIP 3 dă un semnal (co) colocalizat g/portocaliu. Două strategii diferite sunt utilizate pentru a afișa teste FISH cu două și trei culori în combinație cu imunofluorescența CD 30; i. e. , testele cu două culori (A–C și E și F) sunt afișate folosind un afișaj cu trei culori, în timp ce un afișaj multicolor fals, așa cum este obținut de software-ul Isis, este aplicat pentru testul cu trei culori (D) pentru a afișa simultan patru culori ( adică CD 30 [r], TNFAIP 3 [g] și portocaliu și centromerul cromozomului 6 [b]).

Înregistrarea digitală a microimaginilor a deschis posibilitatea conversiei în pseudoculori nu numai a combinațiilor de fluorofori, ci și a rapoartelor, intensităților acestora.

Colorarea multicoloră a cromozomilor (Muli. Color Banding - MSV) Această metodă nu este destinată unei analize complete a tuturor cromozomilor, ci unei analize detaliate a unui singur cromozom. Sondele ADN specifice locului sunt marcate cu diferiți fluorofori sau combinații de fluorofori, astfel încât nivelul semnalului fiecăreia dintre sondele ADN variază în intensitate. Profilurile de intensitate suprapuse ale semnalelor sondei ADN oferă variații ale raporturilor intensităților fluorescenței diferiților fluorofori de-a lungul cromozomului. Rapoartele de intensitate pot fi traduse în pseudoculori și astfel fiecare punct al imaginii și, în consecință, fiecare dintre loci cromozomiali, va avea propria pseudocoloră. Această versiune a metodei FISH multicolor s-a dovedit a fi foarte eficientă în analiza nu numai a rearanjamentelor intercromozomiale, ci și a intracromozomiale în bolile oncologice. Cu toate acestea, pentru aplicarea sa cu succes, este necesar să se determine mai întâi cromozomul care va fi investigat. Această metodă de citogenetică moleculară este potrivită pentru analiza tulburărilor cariotipului asociate cu anumiți cromozomi.

Până în prezent, au fost create seturi de sonde ADN care furnizează MCV pentru toți cromozomii umani de pe cromozomul 5; benzi multicolore ale cromozomului 5; idiograma cromozomului 5; fluorocromii utilizați pentru MSV).

Citogenetica metafază, care a apărut istoric mai devreme decât citogenetica interfazică, face posibilă determinarea unei game largi de tulburări cromozomiale, dar pentru aceasta este necesar ca celulele studiate să fie în stadiul de metafază al meiozei.

Cariotiparea multicoloră Analiza se realizează folosind sonde ADN de colorare continuă a brațelor sau a cromozomilor întregi (sonde WCP - vopsea cromozomială întreg). Astfel de sonde hibridizează cu numeroase secvențe scurte de ADN situate de-a lungul întregii lungimi a cromozomului. Astfel, atunci când este privit la un microscop fluorescent, cromozomul apare uniform colorat într-o anumită culoare.

Sondele ADN utilizate pentru această analiză constau dintr-un amestec de sonde solide de colorare pentru întregul set de cromozomi umani, marcate cu o combinație de mai mulți fluorocromi, al căror raport este selectat individual pentru fiecare pereche de cromozomi. Utilizarea metodelor de înregistrare adecvate și a programelor de calculator pentru analiza imaginilor, care evaluează intensitatea luminiscenței tuturor fluorocromilor pentru fiecare punct al imaginii, face posibilă efectuarea cariotipării, în care fiecare pereche de cromozomi are propria „pseudocoloră” unică. ".

M-FISH (multitarget multifluor multicolor sau multiplex. FISH) este denumirea generică pentru FISH multicolor tradițional care utilizează seturi de filtre specifice fluorocromului. Principiul M-FISH constă în înregistrarea digitală separată a semnalului tuturor fluorocromilor utilizați, care se realizează prin schimbarea secvențială a setului de filtre. Toate imaginile sunt înregistrate în fișiere separate, ceea ce face posibilă procesarea lor eficientă asociată cu separarea semnalului și a fundalului, precum și cuantificarea semnalului. Procesarea tuturor informațiilor înregistrate cu ajutorul unui software special traduce informații despre nivelul semnalelor fluorocrom în fiecare punct al imaginii în pseudocolori. Una dintre principalele limitări ale numărului de sonde ADN utilizate este numărul de fluorocromi disponibili, cu spectre de excitație și emisie care nu se suprapun și disponibilitatea seturilor de filtre adecvate.

24-color FISH Cel mai utilizat M-FISH este 24-color FISH pentru identificarea simultană a materialului din toți cromozomii umani. Este foarte eficient în detectarea translocațiilor cromozomiale, dar nu este conceput pentru a detecta deleții și inversiuni. Cu toate acestea, această problemă poate fi parțial rezolvată prin colorarea simultană a cromozomilor cu DAPI, ceea ce face posibilă analiza striării diferențiale a cromozomilor al căror material cromozom a fost deja identificat. Din păcate, trebuie remarcat faptul că calitatea benzării cromozomilor DAPI după M-FISH este semnificativ inferioară colorării diferențiale GTG și chiar a benzării DAPI după hibridizarea convențională in situ.

Rx. FISH Principiul M-FISH a fost utilizat pentru a genera un cod de bare multicolor pentru cromozomi umani și o metodă de bandă cromozomală multicoloră bazată pe hibridizarea interspecie in situ. Spre deosebire de FISH cu 24 de culori, această metodă face posibilă detectarea directă a unei părți a rearanjamentelor intracromozomiale. Sonde ADN utilizate în Rx. FISH marcat cu o combinație de 3 fluorocromi, care oferă 7 pseudo culori. Ei colorează în mod specific regiunile individuale ale cromozomilor, creându-le striații de culoare. Această caracteristică a probelor de ADN pentru Rx. FISH este determinat de modul în care sunt obținute. Sunt biblioteci de ADN specifice cromozomilor a două specii de gibon: Hylobates concolor și Hylobates syndactylus.

Ca urmare a rearanjamentelor cromozomiale intense care au avut loc în timpul formării speciilor moderne de giboni, materialul cromozomilor lor s-a dovedit a fi foarte amestecat în comparație cu organizarea cromozomilor la oameni, ai căror cromozomi sunt cunoscuți pentru conservatorismul lor. Raportul dintre cromozomul 1 uman și cromozomii gibon este prezentat în Figura 1,

Figura 2 prezintă o vedere generală a cromozomilor umani obținuți ca rezultat al Rx. PEŞTE. a) Placa metafazica b) Dispunerea cromozomilor.

Cu toate acestea, RXFISH are limitări serioase - rearanjamentele cromozomilor care au avut loc într-o bandă de culoare RX nu pot fi detectate folosind această metodă decât dacă conduc la modificări semnificative și ușor vizibile ale dimensiunii acestei benzi. - sondele colorează mai multe regiuni cromozomiale ale diferiților cromozomi într-o singură pseudocoloră. Cu toate acestea, pe măsură ce numărul de fluorocromi utilizați crește, metoda RXFISH va fi, fără îndoială, mai informativă decât peștele de rutină cu 24 de culori.

Avantajele RXFISH în prezent includ următoarele puncte: Metoda permite analiza întregului genom uman într-un singur experiment FISH multicolor. Sunt disponibile seturi comerciale de sonde ADN marcate și sistemele de detectare necesare. Metoda permite identificarea rapidă a unei părți semnificative a rearanjamentelor intra și intercromozomiale. Identificarea automată a cromozomilor metafazici ai „bande de culoare” este posibilă. Fiecare cromozom uman are un cod de bare de culoare unic. RXFISH este integrat în stația de lucru Cyto. Sisteme standard de microscopie cu fluorescență și vedere.

Cariotiparea spectrală (SKY-spectralkaryotyping) Principiile de bază ale analizei imaginii microscopice în cariotiparea spectrală sunt practic aceleași cu cele utilizate în M-FISH. Diferențele sunt legate de modul în care este înregistrată imaginea. Tehnologia SKY vă permite să obțineți curbe spectrale pentru toate punctele imaginii în timpul unei măsurători, indiferent dacă aceasta este asociată cu epifluorescența sau cu microscopia cu lumină tradițională. Pentru cariotiparea spectrală a tuturor cromozomilor umani se folosesc cinci fluorocromi, unul în spectrul verde, doi în roșu și doi în infraroșu. Excitarea și emisia tuturor fluorocromilor utilizați în marcarea sondelor ADN are loc cu un singur set de filtre, ceea ce face posibilă evitarea schimbării lor secvențiale, focalizarea intermediară și, în consecință, problemele conexe, cum ar fi deplasarea spațială a imaginii, determinarea valorilor prag. și măști de segmentare. Pe baza analizei curbelor spectrale, se determină prezența sau absența fluorocromilor specifici la un punct dat.

Următorul pas este procedura de clasificare, care vă permite să determinați direct și fără ambiguitate afilierea cromozomială a materialului analizat. Acest lucru asigură identificarea fiabilă (până la cromozom) a materialului cromozomial marker, precum și a derivaților cromozomi care rezultă din diferite rearanjamente. Marele avantaj al SKY este că colorarea DAPI este înregistrată paralel cu imaginea spectrală. Îmbunătățirea software a benzării DAPI face posibilă obținerea unei striații diferențiale în calitate apropiată de cea a benzării GTG. Posibilitatea analizei paralele a imaginii spectrale și colorării diferențiale calitative a cromozomilor simplifică foarte mult interpretarea rezultatelor SKY și permite o determinare mai precisă a punctelor de rupere a cromozomilor. Avantajele indubitabile ale SKY includ posibilitatea de a utiliza fluorocromi cu spectre de excitație și emisie suprapuse, ceea ce extinde în mod semnificativ lista de fluorocromi utilizabili și, de asemenea, crește numărul de fluorocromi care pot fi utilizați simultan. Listarea unui nou fluorocrom nu necesită achiziționarea unui nou set de filtre, deoarece o unitate de filtru pentru FISH spectral și o unitate de filtru pentru DAPI sunt suficiente pentru SKY.

Dezavantajele SKY includ: - timp mare de expunere, necesar inregistrarii imaginilor microscopice. - SKY este ceva mai puțin eficient decât M-FISH când vine vorba de cercetare cu sonde ADN relativ mici.

Cariotiparea cu schimbarea culorii (CCKs Cariotiparea cu schimbarea culorii) Această metodă se bazează pe analiza diferenței de lungime a semnalului dintre probele de ADN hibridizate cu sonde de ADN asociate cu fluorocromi și sonde de ADN care poartă anticorpi. Metoda este fezabilă cu doar 3 filtre și nu necesită camere speciale și software. Pentru a identifica cromozomii, se realizează o hibridizare și se obțin două imagini. Metoda se bazează pe diferența de lungime a semnalului fluorescent, deoarece timpul de expunere al probelor de ADN asociate cu anticorpi este cu 80 - 90% mai mic decât cel al probelor asociate cu fluorocromi. După reacția de hibridizare, tampoanele sunt expuse la anticorpii primari corespunzători și apoi vizualizate pentru a obține prima imagine. Lamelele sunt apoi expuse la anticorpi secundari și avidina legată de aceiași fluorocromi. Cursurile pot fi contracolorate folosind DAPI.

În viitor, imaginile preparatelor sunt obținute din nou folosind 3 filtre pe rând. Aceste imagini sunt comparate folosind un software special și se obține o a doua imagine, în care vor fi vizibili doar cromozomii asociați cu anumiți anticorpi. Astfel, unii cromozomi vor avea fluorescență doar pe prima sau pe a doua imagine, în timp ce alții își vor schimba culoarea pe diferite imagini.

Hibridizare genomică comparativă (CGH) Metoda a fost creată pentru a identifica tulburările cantitative în genom. Se bazează pe realizarea unei reacții de hibridizare in situ folosind întregul genom ca sondă ADN. ADN-ul donator izolat și normal este marcat cu fluorocromi de diferite culori, transformându-le astfel în sonde ADN. Cantități echivalente din aceste sonde sunt amestecate și utilizate în hibridizare cu un preparat citogenetic martor. După FISH, metafazele sunt analizate la un microscop fluorescent, utilizând un program specializat de analiză a imaginii computerizate pentru a determina intensitatea fluorescenței a doi fluorocromi pe toată lungimea fiecărui cromozom.

În absența modificărilor cantitative ale cariotipului probei de testat, se va observa un anumit raport al intensității luminiscenței celor doi fluorocromi. În cazul amplificării genelor, intensitatea semnalului fluorocromului corespunzător va crește, iar în cazul pierderii unei părți din materialul genetic, dimpotrivă, se va slăbi. Astfel, CGH face posibilă detectarea dezechilibrului genomic, dar această metodă nu poate fi utilizată pentru a detecta translocații și inversiuni echilibrate, iar trisomiile și delețiile pot fi detectate doar dacă dimensiunea regiunii dezechilibrate este de cel puțin 10 milioane de perechi de baze.

Dezechilibrul cromozomal din proba de testat este estimat din diferența de intensitate a fluorescenței a doi fluorocromi diferiți prin calcularea raportului fluorescent (FR).

Metoda CGH are o serie de avantaje față de alte metode de analiză a modificărilor genomului: În primul rând, nu depinde de sursa materialului de testat și poate fi efectuată cu succes cu o cantitate mică de ADN testat, inclusiv material de arhivă. În al doilea rând, permite obținerea de informații detaliate despre pierderea sau creșterea numărului de copii ale materialului genetic în întregul genom într-un singur experiment. În al treilea rând, metoda CGH nu necesită prepararea unor preparate de cromozomi metafazici din țesutul studiat, adică nu depinde de procesul de cultură celulară și de artefactele aferente.

Hibridizarea genomic situ (hibridizarea genomicin situ in, GISH) este o varianta a metodei de hibridizare situ, care consta in faptul ca pentru hibridizarea cu probe fixe, ADN-ul genomic total al unei specii de organism este folosit ca sonda marcata fluorescent, cu cu care concurează ADN-ul genomic total al altei specii de organism; utilizat pentru determinarea diferențelor între specii și intraspecii în genom, rearanjamente cromozomiale, deleții și substituții.

Variații FISH 1) Q-FISH – cantitativ FISH: Dezvoltat de Lansdorp et al: U. M. Martens, J. M. Zijlmans, S. S. Poon, W. Dragowska, J. Yui, E. A. Chavez, R. K. Ward și P. M. Lansdorp. 1998. Telomeri scurti pe cromozomul uman 17 p. Nat. Genet. 18:76-80. metoda cantitativă. Proiectat pentru a funcționa cu citometria în flux. Folosit inițial pentru a măsura lungimea cromozomilor (rezoluție: 200 bp) prin numărarea numărului de repetări telomerice. Sunt utilizate sonde conjugate cu PNA. Inițial, au fost studiati cromozomii de metafază (QFISH propriu-zis), acum, această metodă este aplicabilă și cromozomilor de interfază (IQ-FISH). Q-FISH se efectuează pe culturi celulare, secțiuni de țesut (ambele pe ochelari). În prezent, Q-FISH este un instrument important în studiul rolului telomerilor în procesele de îmbătrânire și formare a cancerului.

PNA-FISH - Acizi nucleici peptidici FISH: Acizii nucleici peptidici (PNA) sunt analogi sintetici ai ADN-ului în care coloana vertebrală de zahăr a fosfatului dezoxiribozei, care susține baza azotată, este înlocuită cu o coloană vertebrală peptidică neîncărcată. Ca rezultat al acestei structuri: nu are loc repulsie electrostatică atunci când sonda PNA-oligomeră hibridizează cu ADN/ARN complementar. Duplexurile PNA-ADN (PNA-ARN) sunt mult mai stabile decât homo/heteroduplexurile naturale. Specificitate ridicată a legării PNA-ADN: hibridizarea PNA-ADN este mult mai sensibilă la nepotrivirea perechilor de baze decât hibridizarea ADN-ADN. Astfel, folosind o sondă PNA, se pot distinge două repetări centromerice, care diferă doar într-o pereche de baze. PNA are o hidrofobicitate relativă (comparativ cu ADN-ul), drept urmare PNA difuzează mai bine prin pereții celulari => aplicare largă în microbiologie. Pe baza specificității ridicate de legare: se crede că tehnologia PNA va deveni în curând baza pentru crearea de sonde specifice alelelor pentru hibridizarea in situ. Este folosit în genetică, citogenetică, epigenetică, microbiologie etc.

3) Flow-FISH - FISH pentru citometrie în flux: Propus în 1998 de: Rufer, N. , Dragowska, W. , Thornbury, G. , Roosnek, E. & Lansdorp, PM Dinamica lungimii telomerelor în subpopulațiile de limfocite umane măsurate prin citometrie în flux . biotehnologia naturii. 16, 743–747 (1998). O combinație de Q-FISH și citometrie în flux care permite analiza (măsurarea) și sortarea semnalului. Pentru flow-FISH, se folosește o suspensie celulară (pentru măsurarea lungimii telomerilor cromozomi), răspândirea cromozomilor și cromozomii izolați (pentru cartografierea ulterioară). La fel ca și în Q-FISH, se folosesc sonde telomerice marcate cu PNA (de exemplu, pentru imagistica și măsurarea lungimii repetițiilor telomerice).Principalul avantaj este o metodă mai rapidă (analiza/sortarea unui număr mare de celule/cromozomi). Este utilizat pe scară largă pentru a studia diverse probleme: îmbătrânirea, conservarea telomerilor, studiul suspensiilor de celule stem hematopoietice ex vivo, studiul bacteriilor.

Analiza multiparametrică permite diferențierea tipurilor de celule într-o singură probă, permițând controlul intern și analiza subtipurilor de leucocite.

Beneficiile flow-FISH: Rezultate ușor reproductibile Capacitatea de a analiza subgrupuri de celule dintr-o populație folosind imunofluorescență fizică și markeri Performanță mai bună decât Q-FISH Capacitate de a cuantifica fluorescența a mii de celule.

INVESTIGAREA CROMOZOMILOR IZOLAȚI PRIN CITOMETRIE în flux 1. Sortarea cromozomilor prin citometrie în flux - Cariotiparea prin citometrie în flux este utilizată pentru cartografierea ulterioară a genelor și construirea de biblioteci de cromozomi. - Identificarea și localizarea genelor pe cromozomi sortați se realizează cu utilizarea ulterioară a metodelor FISH/metodei PRINS (primed in situ labeling) sau a variațiilor acestora și a PCR-ului specific cromozomilor. - Până în 2011, doar cromozomii a 17 specii de plante cultivate au fost sortați cu succes până acum. - Sortarea cromozomilor metafazici sau pahitenici cu indice de diviziune ridicat.

Etichetă fluorescentă: - Cromozomii sunt marcați cu fluorocromi specifici acidului nucleic. - Fluorocromii sunt selectați în conformitate cu 1) specificitatea pentru bazele azotate, 2) condițiile experimentale (inclusiv luând în considerare lungimile de undă ale laserelor disponibile). 1. Pentru analiza monovariantă, utilizați coloranți care nu sunt specifici vaporilor AT sau GC: iodură de propidiu (vârf de excitare: 535 nm, emisii: 617 nm, laser necesar: 488 nm laser cu argon sau lampă + filtru trecere lungă) bromură de etidio ( vârfuri de excitație: : 300 și 520 nm, emisii: 600 nm, laser necesar: 488 nm laser argon sau lampă + filtru trece lung) Aceste etichete colorează ADN-ul indiferent de conținutul de A, G, T sau baze azotate. 2. Pentru analiza bivariată se utilizează: cromomicină (specifică pentru perechile de baze G-C), vârful A 3 excitație: 458 nm, emisie 580 nm. Laser: , 458 nm minim 400 m. V putere. Hoechst 33258 (specific pentru A-T bp), excitație: 351-364 nm, emisie: 470 nm. Laser: 351 -364 nm (puternic). Laserele trebuie separate în timp și spațiu datorită suprapunerii parțiale a spectrelor de fluorocrom.

2. Studiul cromozomilor/secventelor de nucleotide dupa sortare (pentru construirea hartilor fizice si genetice etc.) FISH BAC-FISH PRINS C-PRINS Studiul genomilor mari cu cromozomi lungi. Maparea secvențelor cu un număr mare de repetări (ex: regiuni telomerice și centromerice). Utilizarea sondelor scurte. Datorită numărului mare de repetări, semnalul este puternic. Dimensiunea sondei standard: 15 - 30 nucleotide. PEŞTE

Probleme FISH: este dificil să se localizeze secvențe ADN cu un singur loc (adică secvențe ADN unice nerepetitive) deoarece semnalul va fi foarte slab atunci când se utilizează sonde scurte standard. Creșterea lungimii sondei la câteva kilobaze pentru a îmbunătăți semnalul va duce la o sensibilitate redusă și => legarea nespecifică. Soluție: BAC-FISH -BAC-FISH este o combinație între metoda FISH și utilizarea clonelor de ADN genomic încorporate în cromozomi artificiali bacterieni (BAC), permițând inserarea de secvențe mari de ADN. - O metodă eficientă de identificare și cartografiere a cromozomilor individuali ai organismelor cu genomi mici. Sondele BAC, overgos (oligonucleotide suprapuse) sunt utilizate ca sondă.

Alternativă la FISH: PRINS PRINS (etichetare amorsată in situ) este o metodă de etichetare a cromozomilor prin recoacere a unui primer ADN oligonucleotidic cu o secvență omoloagă de ADN cromozomial denaturat și extensia ulterioară a primerului in situ cu nucleotide marcate. Descris pentru prima dată de Koch și colab. în 1989 (Koch, JE, Kølvraa, S., Petersen, KB, Gregersen, N. și Bolund, I. (1989) Metode de amorsare a oligonucleotidelor pentru etichetarea specifică cromozomilor a ADN-ului satelit alfa in situ. Chromosoma 98, 259 –265). PRINS este o alternativă la FISH. Este utilizat pentru localizarea secvențelor de nucleotide, recunoașterea și numărarea cromozomilor metafazici sau interfazici sau a perechilor de cromozomi (inclusiv aneuploidia cromozomială). recoacerea primerului nemarcat (primer-primer) cu ADN-ul de interes; alungirea primerului cu ajutorul ADN polimerazei termostabile și a nucleotidelor marcate; terminarea reacției (atașarea unei molecule de blocare la capătul 3’) Primer: Fragment de restricție PCR; - indirect (biotină/ dig fluorocrom conjugat avidină/ anti-dig) - Doar o pereche de cromozomi omologi (un cromozom) poate fi identificată în rezultatele fiecărei reacții PRINS. Următoarea reacție PRINS pe aceeași lamă poate fi efectuată numai după blocarea celei anterioare. - Folosit pentru secvențe de ADN cu un număr mare de repetări.

Avantajele PRINS: 1. Necesită informații de secvență minime necesare pentru sinteza unui primer oligonucleotidic. 2. Cea mai rapidă și simplă metodă de detectare a unei secvențe de interes pe un cromozom (comparativ cu utilizarea sondelor FISH grele care hibridizează pe o perioadă foarte lungă de timp). 3. Excluderea etapei de etichetare a sondei. 4. Capacitatea de a alungi primerul cu nucleotide marcate pentru a spori semnalul c-PRINS atunci când se detectează secvențe scurte unice. Pentru a identifica repetițiile cu copii reduse sau secvențele unice scurte, se folosește o metodă mai sensibilă - ciclul PRINS (c-PRINS). C-PRINS a fost propus de Gosden et al. în 1991, un protocol îmbunătățit utilizat pe scară largă de Kubaláková și colab. , 2001 (Kubaláková M, Vrána J, Cíhalíková J, Lysák MA, Dole J (2001). Localization of DNA sequences on plant chromosomes using PRINS and C-PRINS. Methods in Cell Science 23: 71-82). C-PRINS include o serie de cicluri termice similare cu PCR.

Fluid de înveliș pentru FISH: -BD Bioscience Standard (GM Baerlocher, I Vulto, G de Jong, PM Lansdorp. Citometrie în flux și FISH pentru a măsura lungimea medie a telomerilor (flow FISH). 2006. Nature Protocols 1, - 2365 – 2376) -40 m. M KCI + 10 m. M Na. Cl (Vrána J, Kubaláková M, Simková H, Cíhalíková J, Lysák MA, Dolezel J. Sortarea în flux a cromozomilor mitotici în grâul comun (Triticum aestivum L.). Genetica. 2000; 156(4): 2033-41) -Mg . So 4 tampon fără ditiotreitol (Lj. Li, L. Ma, K. Arumuganathan, YC Song. Flow-sorted chromosomes: a fine material for plant gene physical mapping. Caryologia. 2006, vol. 59, nr. 2: 99 -103 )-autoclavat 0,1% (greutate/vol) Na. Cl-50m. M Na. Cl (M Kubaláková, P Kovářová, P Suchánková, J Číhalíková, J Bartoš, S Lucretti, N Watanabe, SF Kianian, J Doležel. Chromosome Sorting in Tetraploid Wheat and Its Potential for Genome Analysis. Genetics. 270052, 170052): 823–829) -Tampon de poliamină stabilizatoare de cromozomi (fluid de înveliș care conține proteine) (Darzynkiewics Z, Robinson JP, Crissman H. Flow Cytometry, Ed. a 2-a, Partea B. San Diego, CA. Academic Press, Inc. 1994)

Microscoapele standard nu fac posibilă examinarea celulelor la nivel molecular. O creștere puternică nu este suficientă aici. Sunt necesare imagini digitale, reactivi suplimentari și alte materiale și instrumente. Pentru analiza ADN-ului și ARN-ului se utilizează în prezent o metodă, care se numește hibridizare in situ. Deoarece implică colorarea probelor urmată de analiza radiațiilor, se mai numește hibridizare fluorescentă sau FISH.

Hibridizarea in situ fluorescentă este utilizată pe scară largă în cercetarea genetică, diagnosticarea cancerului, managementul sarcinii și multe alte domenii ale științei. Metoda, după cum sugerează și numele, se bazează pe proprietatea moleculelor de ADN și ARN de a forma legături stabile cu sonde, adică de a forma molecule hibride. Cuvintele „In situ” înseamnă că toate observațiile sunt făcute „in situ”, adică direct, fără utilizarea unui mediu suplimentar.

Sondele ADN (sondele) sunt complementare cu moleculele din proba de testat. Acestea includ nucleozide, care sunt marcate cu fluorofori (substanțe care conferă moleculei proprietatea de fluorescență). Această metodă se numește etichetare directă; dacă se folosesc ca markeri molecule conjugate hibride, se obține marcarea indirectă. Cu etichetare directă, hibridizarea poate fi observată la microscop cu fluorescență imediat după finalizarea acesteia. Pentru etichetarea indirectă se efectuează o altă procedură de colorare. Separă moleculele conjugate de probele studiate după culoare.

Metoda de hibridizare cu etichetare indirectă necesită mai mult timp și reactivi, dar vă permite să obțineți rezultate mai fiabile. Nivelul semnalului în acest caz va fi mai mare și, în plus, este posibilă și amplificarea lui în trepte. Secvențele de ADN donate (produse PCR, ADN genomic, oligonucleotide marcate și altele) sunt utilizate ca sonde de marcare. Etichetarea sondei se realizează în mai multe moduri. Metodele comune sunt translația nick și reacția în lanț a polimerazei (PCR) cu nucleotide marcate.

Ordinea procedurii

Metoda In situ începe cu o etapă pregătitoare - proiectarea sondelor. Dimensiunile sondelor nu trebuie să fie suficient de mari pentru a interfera cu procesul de cercetare. Sondele prea mici sunt, de asemenea, nedorite, deoarece nu garantează rezultate fiabile. Prin urmare, pentru cercetare sunt luate sonde de până la 1.000 bp. Dacă sonda este ADN dublu catenar, atunci acidul este denaturat înainte de hibridizare. Când se obține rezultatul dorit (anumite regiuni ale cromozomilor sau toți cromozomii sunt colorați), hibridizarea ulterioară a sondelor ADN cu secvențe repetate este blocată. Pentru a face acest lucru, la amestecul de hibridizare sunt adăugate molecule repetate de ADN nemarcate.

Următoarea etapă a cercetării este pregătirea preparatelor de nuclee interfazice sau cromozomi metafazici. Celulele sunt fixate în substrat pe sticlă, după care ADN-ul este denaturat. Pentru a reduce temperatura de denaturare și a păstra morfologia nucleelor și a cromozomilor, denaturarea se realizează cu adăugarea de formadidă. După aceea, sondele sunt adăugate la material și hibridizarea se efectuează timp de câteva ore. La finalizarea acesteia, se efectuează o spălare în mai multe etape pentru a îndepărta sondele care nu s-au conectat cu moleculele probei.

O metodă modernă de analiză citogenetică, care permite determinarea modificărilor calitative și cantitative ale cromozomilor (inclusiv translocații și microdeleții) și este utilizată pentru diagnosticul diferențial al bolilor maligne ale sângelui și al tumorilor solide.

Sinonime în rusă

Hibridare fluorescentă in situ

Analiza FISH

Sinonime în engleză

Fluorescenţă in-situ hibridizare

Metodă de cercetare

Hibridare fluorescentă in situ.

Ce biomaterial poate fi folosit pentru cercetare?

Probă de țesut, probă de țesut în bloc de parafină.

Cum să vă pregătiți corect pentru cercetare?

Nu necesită pregătire.

Informații generale despre studiu

Hibridizare fluorescentă in situ (FISH) în- situ hibridizarea) este una dintre cele mai moderne metode de diagnosticare a anomaliilor cromozomiale. Se bazează pe utilizarea sondelor ADN marcate cu o etichetă fluorescentă. Sondele ADN sunt fragmente de ADN special sintetizate, a căror secvență este complementară cu secvența ADN a cromozomilor aberanți studiati. Astfel, probele de ADN diferă ca compoziție: probe de ADN diferite, specifice sunt utilizate pentru a determina diferite anomalii cromozomiale. Sondele ADN variază, de asemenea, în mărime: unele pot fi direcționate către un cromozom întreg, altele către un anumit locus.

În timpul procesului de hibridizare, dacă există cromozomi aberanți în proba de testat, aceștia se leagă de sonda ADN, care, atunci când este examinată cu un microscop fluorescent, este determinată ca un semnal fluorescent (un rezultat pozitiv al testului FISH). În absența cromozomilor aberanți, probele de ADN nelegate sunt „spălate” în timpul reacției, care, atunci când este examinată cu un microscop fluorescent, este definită ca absența unui semnal fluorescent (rezultat negativ al testului FISH). Metoda face posibilă evaluarea nu numai a prezenței unui semnal fluorescent, ci și a intensității și a localizării acestuia. Astfel, testul FISH nu este doar o metodă calitativă, ci și cantitativă.

Testul FISH are o serie de avantaje față de alte metode citogenetice. În primul rând, studiul FISH poate fi aplicat atât la nucleele metafază, cât și la interfaza, adică la celulele care nu se divizează. Acesta este principalul avantaj al FISH față de metodele clasice de cariotipare (de exemplu, colorarea cromozomilor Romanowsky-Giemsa), care sunt aplicate numai nucleelor metafazate. Acest lucru face ca FISH să fie o metodă mai precisă pentru detectarea anomaliilor cromozomiale în țesuturi cu activitate proliferativă scăzută, inclusiv tumori solide.

Deoarece testul FISH folosește ADN stabil al nucleelor de interfaza, o mare varietate de biomateriale pot fi utilizate pentru cercetare - aspirații de biopsie cu aspirație cu unghi fin, frotiuri, aspirate de măduvă osoasă, specimene de biopsie și, mai important, fragmente de țesut conservate, cum ar fi blocurile histologice. . Astfel, de exemplu, un test FISH poate fi efectuat cu succes pe preparate repetate obținute dintr-un bloc histologic al unei probe de biopsie mamară atunci când se confirmă diagnosticul de „adenocarcinom mamar” și necesitatea determinării statusului HER2/neu al tumorii. De subliniat că în momentul de față studiul FISH este recomandat ca test de confirmare la primirea unui rezultat nedeterminat al studiului imunohistochimic al tumorii pentru markerul tumoral HER2/neu (IHC 2+).

Un alt avantaj al FISH este capacitatea sa de a detecta microdeleții care nu sunt detectate prin cariotiparea clasică sau PCR. Acest lucru este deosebit de important în cazurile de suspectare a sindromului DiGeorge și a sindromului velocardiofacial.

Testul FISH este utilizat pe scară largă în diagnosticul diferenţial al bolilor maligne, în primul rând în oncohematologie. Anomaliile cromozomiale în combinație cu tabloul clinic și datele imunohistochimice sunt baza pentru clasificarea, determinarea tacticilor de tratament și prognosticul bolilor limfo- și mieloproliferative. Exemplele clasice sunt leucemia mieloidă cronică - t (9; 22), leucemia promielocitică acută - t (15; 17), leucemia limfocitară cronică - trisomia 12 și altele. În ceea ce privește tumorile solide, studiul FISH este cel mai des utilizat în diagnosticul cancerelor de sân, vezică urinară, colon, neuroblastom, retinoblastom și altele.

Studiul FISH poate fi folosit și în diagnosticul prenatal și preimplantare.

Testul FISH este adesea efectuat în combinație cu alte metode de diagnosticare moleculară și citogenetică. Rezultatul acestui studiu este evaluat împreună cu rezultatele datelor suplimentare de laborator și instrumentale.

La ce se folosește cercetarea?

Pentru diagnosticul diferențial al bolilor maligne (sânge și organe solide).

Când este programat studiul?

Dacă bănuiți prezența unei boli maligne de sânge sau a unei tumori solide, tactica de tratament și prognosticul cărora depind de compoziția cromozomială a clonei tumorii.

Ce înseamnă rezultatele?

Rezultat pozitiv:

Prezența cromozomilor aberanți în proba de testat.

rezultat negativ:

Absența cromozomilor aberanți în proba de testat.

Ce poate influența rezultatul?

Numărul de cromozomi aberanți.

Studiu imunohistochimic al materialului clinic (folosind 1 anticorp)
Studiu imunohistochimic al materialului clinic (folosind 4 sau mai mulți anticorpi)
Determinarea statusului tumorii HER2 prin FISH
Determinarea statusului tumorii HER2 prin metoda CISH

Cine comandă studiul?

Oncolog, pediatru, obstetrician-ginecolog, genetician.

Literatură

Wan TS, Ma ES. Citogenetica moleculară: un instrument indispensabil pentru diagnosticul cancerului. Anticancer Res. 2005 iulie-aug;25(4):2979-83.
Kolialexi A, Tsangaris GT, Kitsiou S, Kanavakis E, Mavrou A. Impactul studiilor citogenetice și moleculare citogenetice asupra malignităților hematologice. Chang Gung Med J. 2012 Mar-Apr;35(2):96-110.
Mühlmann M. Citogenetica moleculară în celulele metafază și interfazice pentru cancer și cercetare genetică, diagnostic și prognostic. Aplicare în secțiuni de țesut și suspensii celulare. Genet Mol Res. 30 iunie 2002;1(2):117-27.