Caracteristicile citocromului p450 și rolul biologic. citocromi P450

Polunina T.E.

Oksana Mihailovna Drapkina

– Ne continuăm programul. Se termină prelegerile și discuțiile noastre despre ginecologie, am intrat complet în regulament, așa că vom încerca să nu le părăsim. Profesorul Tatyana Evgenievna Polunina deschide secțiunea de gastroenterologie. Prelegeri „Rolul familiei citocromului P450 în patogeneza și tratamentul bolii hepatice grase non-alcoolice.”

Tatiana Evghenievna Polunina, profesor, doctor în științe medicale:

– Citocromii P450 (CYP 450) este numele unei familii mari de enzime universale din corpul uman. Citocromii P450 joacă un rol important în oxidarea a numeroși compuși, precum compușii endogeni (steroizi, acizi biliari, acizi grași, prostaglandine, leucotriene, amine biogene), precum și compuși exogeni (medicamente, poluare industrială, pesticide, agenți cancerigeni și mutageni). ), acestea din urmă se numesc xenobiotice.

În acest slide puteți vedea unde sunt localizați citocromii P450. Sunt localizate în hepatocit, în citosol. Reticulul endoplasmatic este baza pentru localizare. Și, în special, membrana lipidică, care conține un strat dublu de fosfolipide, are mai multe structuri conectate pe ea. Acesta este un citocrom, care include proteina de fier, nicotinamidă adenin dinucleotidă și oxidoreductază, care este inclusă în complexul de metabolism al medicamentelor și xenobioticele prezentate mai sus.

Cei mai comuni reprezentanți ai acestui grup la care se îndreaptă clinicienii sunt citocromii P452 AC, P450 2D, P450 2E1, P450 3A4. Aceste enzime catalizează o gamă largă de reacții metabolice și un citocrom poate metaboliza mai multe medicamente care au structuri chimice diferite. Același medicament are efecte diferite în citocromul P450 și în diferite organe. Și, în special, cel mai important citocrom căruia îi acordăm atenție este citocromul P450 2E - cea mai importantă izoenzimă a citocromului P450, care descompune lipoproteinele cu densitate scăzută.

În prezent, nu au fost dezvoltate numai metode de fenotipizare care se bazează pe specificitatea substratului anumitor izoenzime citocromului P450, ci și activitatea unei anumite enzime și metabolismul este determinată de farmacocinetica substratului marker și de modificările concentrațiilor substanței nemodificate. și metabolitul său. Dar determinarea izoenzimelor citocromului P450 prin identificarea genelor pentru izoenzimele corespunzătoare se realizează folosind o reacție în lanț a polimerazei. Aceasta se numește genotipare a izoenzimei citocromului P450.

Pe acest slide vedem că în hepatocit se află locul unde reticulul endoplasmatic, citocromii P450, dintre care sunt mai mult de 50, și medicamentele care sunt descompuse într-un anumit citocrom, în unele cazuri se combină cu citocromul și formează o veziculă care lezează hepatocitul, provocând în același timp stres și citokine; duce la activarea factorului necrotic tumoral și, în special, este un factor declanșator pentru lansarea caspazelor, care se manifestă prin procese catalitice.

Boala ficatului gras non-alcoolic, care a fost ulterior identificată ca o entitate nosologică, a început să fie numită boală hepatică grasă non-alcoolică (NAFLD) din 1980, după ce s-au descoperit modificări ale ficatului la pacienții nealcoolici care erau similare cu cele observate la daune induse de alcool.

Istoria naturală a bolii hepatice grase non-alcoolice include steatoza ca stadiu inițial, care, fără a progresa, poate fi asimptomatică și steatohepatita, care este însoțită de manifestări vegetative teribile, sindromul de citoliză și manifestări dispeptice. Odată cu dezvoltarea fibrozei, apare o problemă destul de gravă - ciroza hepatică și, ulterior, se dezvoltă hipertensiunea portală și carcinomul.

Aș dori să vă atrag atenția asupra faptului că, în 1894, Kiernan a propus o anumită arhitectură a ficatului, care constă dintr-o structură de grinzi. La periferia fasciculelor, care constau din hepatocite poligonale, există o triadă: canal biliar, venă portă și arteră. Acest diapozitiv reprezintă un ficat normal sănătos și o infiltrare grasă a hepatocitelor. Steatoza hepatică, care este una dintre primele faze de dezvoltare a bolii hepatice grase nealcoolice, este prezentată în formă morfologică în această diagramă.

Următoarea opțiune pentru dezvoltarea procesului inflamator, care duce la răspândirea țesutului fibros în tot ficatul, vedem steatohepatita și ulterior ciroza hepatică cu dezvoltarea hipertensiunii portale. Cel mai adesea, aceasta este ciroza micronodulară a ficatului, care este deja destul de clar stabilită în etapele de dezvoltare a bolii hepatice grase nealcoolice, este însoțită de hipertensiune portală, varice ale esofagului, stomacului, complicații tipice pentru ciroza hepatică și moartea.

Cu steatohepatita non-alcoolică, cele mai frecvente evoluții sunt cele care se asociază cel mai adesea ca boli concomitente: diabet zaharat, obezitate. La pacienți, steatohepatita non-alcoolică se dezvoltă până la 75%, iar dacă diabetul zaharat și obezitatea sunt combinate, atunci 90% dintre pacienți au boală hepatică grasă non-alcoolică.

Ficatul este, fără îndoială, principalul organ țintă afectat de sindromul metabolic. Rezistența la insulină este o caracteristică cheie care stă la baza acumulării lipidelor intrahepatocitare, a ficatului gras, a steatohepatitei non-alcoolice și a cirozei hepatice.

Aș dori să atrag atenția asupra faptului că sindromul metabolic include nu numai toleranța afectată la glucoză, ci și dislipidemia, obezitatea abdominal-viscerală, rezistența la insulină și hiperinsulinemia, hipertensiunea arterială, ateroscleroza precoce, alterarea hemostazei, hiperuricemia, hiperandrogenismul. Aș dori să spun că boala ficatului gras non-alcoolic, steatoza, face parte din sindromul metabolic și este în prezent un cvintet care se numea „cvartetul mortal”.

Factorii de risc prezentați pe acest slide variază uneori de la o țară la alta, pozițiile SUA și pozițiile europene diferând ușor. Dar, cu toate acestea, circumferința taliei, nivelurile de trigliceride, lipoproteinele, tensiunea arterială, în special 130/85, nivelurile de glucoză sunt indicatori care trebuie monitorizați la un pacient cu sindrom metabolic.

Bolile asociate metabolismului lipidic sunt: ​​boala ficatului gras non-alcoolic, diabetul zaharat tip 2, boala coronariană hepatică, hipertensiunea arterială.

În schema de patogeneză, rezistența la insulină a țesutului adipos este de o importanță deosebită. O creștere a lipogenezei, adică o creștere a nivelului de acizi grași, o creștere a sintezei trigliceridelor și lipotoxicitatea duc la dezvoltarea rezistenței la insulină, iar aceasta duce la disfuncție metabolică, stres al reticulului endoplasmatic, în care are loc și metabolismul acizilor grași și în special al lipoproteinelor și la activarea inflamației. Acestea sunt celulele Kupffer și celulele stelate, care duc în continuare nu numai la faptul că nivelul lipidelor cu densitate foarte mică crește, dar, fără îndoială, acest lucru duce la dezvoltarea steatohepatitei cu fibroză și obținem activitatea unui proces care se îndreaptă spre ciroză. a ficatului.

La nivelul hepatocitelor, acizii grași suferă esterificare în trigliceride și sunt exportați ca lipoproteine ​​cu densitate mică, situație în hepatocitul normal care este asociată cu oxidarea în mitocondrii, peroxizomi și microzomi.

Fără îndoială, în mecanismul rezistenței la insulină, care este prezentat aici, un rol cheie revine factorului necrotic tumoral, radicalilor liberi, leptinei, acizilor grași și creșterii lipolizei, ceea ce duce la absorbția acizilor grași, la o încălcare a β- oxidarea acizilor grași din mitocondrii și, de asemenea, la acumularea de acizi grași în hepatocite.

Inducerea citocromilor P450 4A11 și P450 2E1 duce la peroxidarea lipidelor, ceea ce duce, fără îndoială, la activarea factorilor asociați cu acumularea de trigliceride. Hiperinsulinemia este un factor cheie care duce la rezistența la insulină. De asemenea, duce la o creștere a glicolizei, a sintezei acizilor grași și a acumulării de trigliceride în hepatocite.

Următorul diapozitiv arată mecanismul de interacțiune dintre oxidarea microzomală și β-oxidarea mitocondrială. Rețineți că Ω-oxidarea mitocondrială și β-oxidarea mitocondrială duc la declanșarea așa-numiților receptori de β-oxidare peroxizomală și în special a receptorilor activați de proliferatorul peroxizomal. Aceasta duce la exprimarea acumulării unei anumite proteine ​​și, în consecință, a acetil-coenzimei A, care se acumulează și declanșează un mecanism care duce la o supraîncărcare a acizilor grași dicarboxilici.

În următorul diapozitiv vedeți că steatohepatita și fibroza se formează pe fondul speciilor reactive de oxigen mitocondrial. Cheia declanșării fibrozei este, fără îndoială, acumularea de malondialdehidă, care duce la formarea de infiltrate inflamatorii, fibroză și activarea celulelor stelate. Celulele stelate declanșează inducerea citokinelor, cum ar fi factorul necrotic tumoral și factorii de creștere transformanți. Epuizarea sistemului antioxidant duce la lansarea Fas-legand, o specie mitocondrială reactivă a oxigenului, apare necroza hepatocitelor și se dezvoltă ulterior țesutul fibros, care stă la baza dezvoltării cirozei.

Acest diapozitiv prezintă o diagramă, vedeți excesul de lipide care se acumulează în hepatocit. Disfuncția mitocondrială și disfuncția citocromului P450 duce la activarea peroxidării lipidelor, lansarea celulelor Kupffer, citokine inflamatorii, activarea celulelor stelate și apoptoza, ceea ce duce ulterior la dezvoltarea necrozei hepatocitelor.

Sindromul metabolic este foarte important deoarece boala hepatică grasă non-alcoolică face parte din sindromul metabolic. Și nu numai pe hepatocit, în care există o creștere a nivelului de lipoproteine ​​cu densitate mică și foarte scăzută, trigliceride (acest lucru este foarte important), ci și pe celula endotelială. Apare disfuncția endotelială și se declanșează și un moment care este asociat cu peroxidarea lipidelor, acumularea de substanțe care afectează ateroscleroza, moartea subită și atacurile de cord.

Fără îndoială, creșterea nivelului de acizi grași liberi este asociată cu adipocite. Și o scădere a colesterolului esterificat în special duce, de asemenea, la diferite stresuri ale receptorului nuclear. Iar așa-numitul receptor activat de proliferare a peroxizomului este deosebit de important în prezent, spre acesta se îndreaptă toată atenția oamenilor de știință care lucrează cu obezitate, diabet și boala ficatului gras non-alcoolic.

Un monocit (macrofag), în unele cazuri, prin creșterea nivelului de respondenți inflamatori (factor necrotic tumoral, interleukine-6, receptori de tip toll-like membranari, acizi grași liberi) declanșează, de asemenea, evenimente care sunt asociate în mod specific cu efectele patologice ale grașilor. acizi.

Criteriile de evaluare a rezistenței la insulină sunt cunoscute de toată lumea din 1985. Este determinat de indicele HOMA - Homeostasis Model Assessment, și de cel mai modern indice QUICKI - Quantitave Insulin Sensitivity. Concentrația de insulină, glucoza serică și normele sunt prezentate aici.

Dorim să subliniem că nu toți pacienții cu boală hepatică grasă non-alcoolică au nevoie de biopsie hepatică. În prezent avem puncte care ne permit să determinăm nivelul de infiltrare grasă a ficatului. Și în special acesta este un fibrotest.

În algoritmul de diagnosticare a bolii hepatice grase nealcoolice, acordăm atenție nu numai semnelor specifice, ci și activității enzimelor alanină și aspartic transaminaza, gamma-glutamil transpeptidază, fosfatază alcalină și acordăm atenție consumului de alcool, despre care au discutat colegii anteriori. Și aș dori să atrag atenția, desigur, asupra factorilor de risc: sindromul metabolic, rezistența la insulină, diabetul. Terapia este prescrisă pentru a corecta această situație și, dacă este necesar, o biopsie hepatică. Fără îndoială, sunt necesare indicații absolute pentru biopsie. Și dacă indicele de masă corporală depășește 35 și 40, atunci măsurile legate de tratamentul chirurgical sunt deja efectuate.

Aș dori să vă atrag atenția asupra unui număr de medicamente (nesteroidiene - glucocorticoză antiinflamatoare, și medicamente steroizi, antibiotice tetracicline), o serie de factori nutriționali (post, scădere rapidă în greutate, intervenții chirurgicale, factori genetici metabolici, în în special, hemocromatoza ereditară, diverse otrăvuri) și alte boli concomitente. Acest lucru este foarte important pentru diagnosticul diferențial.

În stadiul de steatoză, tratamentul obezității, rezistenței la insulină și dislipidemiei este important. În stadiul de steatohepatită, cel mai important punct este eliminarea stresului oxidativ, a inflamației și a fibrozei.

Inducerea excesivă a citocromului P450 2E are efecte dăunătoare asupra hepatocitelor datorită eliberării de radicali liberi. Fosfolipidele esențiale acționează nu numai ca antioxidanți, ci servesc și ca un factor foarte important pentru reducerea activității citocromului 2E1, așa cum se arată în lucrările lui M. Aleynik. Rezultatele unor studii sugerează că introducerea fosfolipidelor esențiale poate reduce inducerea citocromului P450 2E (lucrare de Vladimir Trofimovici Ivashkin, care a fost prezentat cu Marina Viktorovna Mayevskaya în surse rusești în 2004).

Celulele stelate iau parte la formarea stadiului final al bolii hepatice grase non-alcoolice. Și în experimente de laborator, s-a demonstrat că prevenirea completă a activării celulelor stelate folosind inhibitori CYP2E1 previne dezvoltarea cirozei.

Aș dori să vă atrag atenția asupra faptului că nu numai autorul rus M. Aleynik, ci și autorul japonez Akiyama din revista „Hepatology” din 2009, bazat pe un model de afectare hepatică alcoolică, acordă atenție citocromului P450. 2E, acetil-CoA oxidază și nicotinamidă adenin dinucleotide oxidaze, că fosfolipidele esențiale prezintă activitate antiinflamatoare, anti-apoptotică și anti-fibrotică în această patologie.

Aceasta este o versiune teoretică a ipotezei utilizării inhibitorilor citocromului P450 și, în special, a medicamentului „Essentiale”, care este referința și este cel mai important punct pentru inhibarea citocromilor P450 2E și, în consecință, P450 4A11. Acest lucru previne oxidarea lipidelor, glicoliza și reduce sinteza acizilor grași.

Următoarele medicamente sunt utilizate în tratamentul bolii hepatice grase nealcoolice: sensibilizatori la insulină, antioxidanți, hepatoprotectori, antimicrobieni.

Dar aș dori să atrag atenția asupra fosfolipidelor membranare. Ele sunt principalele componente lipidice ale membranelor celulare. Deteriorarea membranelor fosfolipide duce la sindromul de citoliză, iar excesul de specii reactive de oxigen duce la deteriorarea membranelor fosfolipide pe baza γ-oxidării microzomale și a β-oxidării peroximale. În consecință, deteriorarea membranelor fosfolipide duce la moartea celulelor, ceea ce duce la inițierea fibrozei și la activarea celulelor stelate.

Deteriorarea structurii ficatului este deteriorarea membranelor. În versiunea fosfolipidelor esențiale, este un material care restabilește membranele celulare în loc de lipide. Restaurarea structurii ficatului face posibilă restabilirea funcției hepatice.

Pacienții noștri suferă nu numai de boală hepatică grasă alcoolică, hepatită alcoolică, ci și de alte boli ale ficatului, acesta este un fapt incontestabil. Aș dori să vă atrag atenția asupra faptului că, conform monografiei E. Kunz (2008), fosfolipidele esențiale au efect antifibrotic, efect care stabilizează bila și membrana hepatocitară.

Aceasta este o publicație care a fost lansată în 2008 pe baza datelor farmacologice și clinice. Terapia cu fosfolipide esențiale pare să fie alegerea preferată pentru reducerea semnificativă a manifestărilor și eliminarea bolii hepatice grase de diverse etiologii, care s-a dezvoltat din cauza consumului de alcool, a obezității și chiar dacă nu se poate discerne cauza.

Aș dori să subliniez că există mai multe studii despre Essential. Aceste studii sunt bine cunoscute de toată lumea. Dar aș dori să spun că, chiar și cu diabet zaharat, Essentiale face posibilă normalizarea nivelului de glucoză, hemoglobinei glicate și colesterol seric la pacienții cu boală hepatică non-alcoolică.

În concluzie, aș dori să spun că afectarea ficatului caracterizată prin acumularea de grăsime în absența abuzului de alcool este cunoscută sub numele de boală hepatică grasă non-alcoolică. Factorii de risc sunt obezitatea și diabetul de tip 2. În patogeneza ficatului gras non-alcoolic, o importanță deosebită este acordată activității excesive a citocromilor P450 2E1. Variante clinice ale evoluției bolii: durere în hipocondrul drept, tulburări astenovegetative și dispeptice, hepatomegalie. Iar algoritmul nostru de diagnostic se bazează pe excluderea consecventă a leziunilor hepatice alcoolice și iatrogenice, precum și a leziunilor hepatice virale.

Oxidarea microzomală este o secvență de reacții care implică oxigenazeȘi NADPH, ducând la introducerea unui atom de oxigen în compoziția unei molecule nepolare și la apariția hidrofilității în aceasta și crește reactivitatea acesteia.

Reacții oxidare microzomală efectuat de mai multe enzime situate pe membranele reticulului endoplasmatic (în cazul in vitro se numesc membrane microzomale). Enzimele organizează lanțuri scurte care se termină cu citocromul P 450.

Reacțiile de oxidare microzomală includ la reacțiile de fază 1și au scopul de a conferi proprietăți polare unei molecule hidrofobe și/sau de a crește hidrofilitatea acesteia, sporind reactivitatea moleculelor de a participa la reacțiile de faza 2. În reacțiile de oxidare are loc formarea sau eliberarea grupărilor hidroxil, carboxil, tiol și amino, care sunt hidrofile.

Enzimele de oxidare microzomală sunt situate în reticulul endoplasmatic neted și sunt oxidaze cu funcție mixtă(monooxigenaze).

Citocromul P450

Proteina principală a oxidării microzomale este hemoproteina - citocromul P 450.În natură, există până la 150 de izoforme ale acestei proteine, care oxidează aproximativ 3000 de substraturi diferite. Raportul dintre diferitele izoforme ale citocromului P450 variază în funcție de caracteristicile genetice. Se crede că unele izoforme sunt implicate în biotransformarea xenobioticelor, în timp ce altele metabolizează compuși endogeni (hormoni steroizi, prostaglandine, acizi grași etc.).

Citocromul P450 interacționează cu oxigenul molecular și include un atom de oxigen în molecula substratului, contribuind la apariția (creșterea) hidrofilității sale, iar celălalt - în molecula de apă. Principalele sale reacții sunt:

• dezalchilare oxidativă, însoțită de oxidarea grupării alchil (la atomii de N, O sau S) la aldehidă și eliminarea acesteia,
• oxidarea (hidroxilarea) compușilor nepolari cu inele alifatice sau aromatice,
• oxidarea alcoolilor la aldehidele corespunzătoare.

Lucrarea citocromului P 450 este asigurată de două enzime:

• NADH-citocrom b 5 oxidoreductaza, conține MOFT,
• NADPH-citocrom P 450 oxidoreductaza, conține FMNȘi MOFT.

Schema pozițiilor relative ale enzimelor de oxidare microzomale și funcțiile acestora

Ambele oxidoreductaze primesc electroni de la echivalenții redusi corespunzători și îi transferă în citocromul P 450. Această proteină, care a atașat anterior o moleculă a substratului redus, se leagă de o moleculă de oxigen. După ce a primit un alt electron, citocromul P 450 încorporează primul atom de oxigen în substratul hidrofob (oxidarea substratului). În același timp, are loc reducerea celui de-al doilea atom de oxigen la apă.

Secvența reacțiilor de hidroxilare a substraturilor cu participarea citocromului P450

O caracteristică esențială a oxidării microzomale este capacitatea de a induce sau inhiba, adică. la o schimbare a puterii procesului.

Inductorii sunt substanțe care activează sinteza citocromului P 450 și transcrierea ARNm-ului corespunzător. Sunt

1. Spectru larg acțiuni care au capacitatea de a stimula sinteza citocromului P 450, NADPH-citocrom P 450 oxidoreductazei și glucuronil transferazei. Reprezentanții clasici sunt derivații acidului barbituric - barbiturice, Acest grup include și diazepam, carbamazepină, rifampicina si etc.

2. Spectru îngustși acțiuni, adică stimulează una dintre formele citocromului P 450 - hidrocarburi policiclice aromatice ( metilcolantren, spironolactonă), etanol.

De exemplu, etanol stimulează sinteza izoformei P 450 2E1 (alcool oxidază), care este implicată în metabolismul etanolului, nitrozaminelor, paracetamolului etc.
Glucocorticoizi induce izoforma P 450 3A.

Inhibitorii oxidării microzomale se leagă de partea proteică a fierului citocrom sau hem. Ele sunt împărțite în:

1. Reversibil

• directactiuni- monoxid de carbon ( CO), antioxidanti,
• indirectactiuni, adică influențează prin produși intermediari ai metabolismului lor, care formează complexe cu citocromul P 450 - eritromicină.

2. Ireversibil inhibitori - alopurinol, aminazină, progesteron, orală contraceptivelor, teturam, fluorouracil,

Evaluarea reacțiilor de fază 1

Oxidarea microzomală poate fi evaluată în următoarele moduri:

• determinarea activității enzimelor microzomale după biopsie,
• privind farmacocinetica medicamentelor,
• folosind markeri metabolici ( testul antipirinic).

Testul cu antipirină

Subiectul îl ia dimineața pe stomacul gol amidopirină la o rată de 6 mg/kg greutate corporală. Se colectează 4 porții de urină la intervale de la 1 la 6 ore, 6-12, 12-24 și, respectiv, 45-48 ore. Se măsoară volumul de urină. Nu mai târziu de 24 de ore mai târziu, urina este centrifugată sau filtrată. În continuare, se examinează concentrația de 4-aminoantipirină și metabolitul său N-acetil-4-aminoantipirină în urină.

Citocromii P450

Superfamilia citocromului P-450 (CYP-450) este responsabilă de oxidarea microzomală și este un grup de enzime cu multe izoforme (mai mult de 1000), care nu numai că metabolizează medicamentele, ci participă și la sinteza hormonilor steroizi, colesterolului și a altora. substante.

Cea mai mare cantitate de citocromi se găsește în hepatocite, precum și în organe precum intestine, rinichi, plămâni, creier, inimă. Pe baza omologiei secvențelor de nucleotide și aminoacizi, izoenzimele citocromului sunt împărțite în familii, care, la rândul lor, sunt împărțite în subfamilii. Reprezentanții diferitelor familii diferă în ceea ce privește specificitatea substratului și regulatorii de activitate (inductori și inhibitori). Deși membrii individuali ai familiilor pot avea specificități „încrucișate” și inductori și inhibitori „încrucișați”. Astfel, s-a demonstrat că medicamentul antiviral ritonavir este metabolizat de șapte enzime (CYP1A1, CYP2A6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP3A4), iar cimetidina inhibă patru enzime (CYP1A2, CYP2C96, CYP42C). Cei mai importanți citocromi pentru biotransformarea medicamentelor sunt CYP1A1, CYP2A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP3A4, CYP3A5. Contribuția relativă a diverșilor citocromi și a altor enzime de detoxifiere de fază I în metabolismul medicamentelor este prezentată în Figura 7.2.2.

Fiecare izoenzimă citocrom P-450 este codificată de propria sa genă, care este localizată pe diferiți cromozomi. Unele dintre aceste gene au pseudogene (copii neexprimate) situate în apropierea lor, ceea ce complică semnificativ testarea genetică.

Datorită polimorfismului genelor metabolice, activitatea enzimelor corespunzătoare poate varia semnificativ între indivizi. În funcție de aceste caracteristici interindividuale, se disting trei grupuri de indivizi, care diferă în activitatea uneia sau alteia enzime metabolice. Aceștia sunt așa-numiții metabolizatori „extensivi” - indivizi cu o rată normală de metabolizare a medicamentelor (cea mai mare parte a populației), metabolizatori „lenti” (indivizi cu o rată redusă de metabolizare a anumitor medicamente) și „rapid” („ hiperactivi”) metabolizatori - indivizi cu o rată crescută de biotransformare a unor medicamente. Proporția metabolizatorilor „lenti” și „rapidi” pentru enzimele metabolice individuale relevă diferențe semnificative între populație. În același timp, nu există întotdeauna o corelație completă între genotip și fenotip în rata metabolismului medicamentului, ceea ce indică necesitatea utilizării controlului biochimic la genotipizarea enzimelor metabolice.

Să luăm în considerare caracteristicile funcționale ale polimorfismului principalelor gene ale superfamiliilor de citocrom CYP-450 implicate în metabolismul medicamentelor. Informații detaliate despre proprietățile enzimelor metabolice, caracteristicile substratului lor și polimorfismul genetic pot fi găsite într-o serie de monografii interne și manuale de farmacogenetică clinică.

Familia P-450 CYP1 metabolizează o proporție relativ mică de xenobiotice, dintre care cele mai importante sunt hidrocarburile aromatice policiclice (HAP), principalele componente ale fumului de tutun.

Un rol deosebit de important în acest sens revine genelor CYP1A1 și CYP1A2, localizate pe cromozomul 15. Expresia ambelor gene este reglată de un complex format de receptorul Ah cu molecula inductoare de HAP, care pătrunde în nucleu și stimulează în mod specific expresia aceste gene.

CYP1A1 codifică o proteină cu activitate arilhidrocarbonat hidroxilază, care controlează metabolismul inițial al HAP, ducând la formarea de agenți cancerigeni (de exemplu, benzopiren, care se formează în timpul fumatului). Polimorfismul genei CYP1A1 este cauzat de trei mutații punctuale: C4887A și A4889G în exonul 7 și T6235C în regiunea de flancare 3’. Substituția G4889(Val)+C6235 este caracterizată prin apariția alelei „rapide” *2B. Are activitate de 3 ori mai mare în comparație cu alela de tip sălbatic. *2B apare la aproape 7% dintre caucazieni și este considerat un factor de risc pentru cancerul pulmonar. S-a demonstrat că în prezența alelei *2B la fumători, riscul de a dezvolta cancer pulmonar în comparație cu nefumătorii crește de peste șapte ori. Riscul devine și mai mare dacă, pe lângă alela *2B a genei CYP1A1, individul fumător are și o alela „deficientă” a genei GSTM1. Alelele *2A (C6235) și *4 (A4887(Asp) apar în populație cu o frecvență de numai 1-3%. Mai mult, alela *2A este asociată cu o predispoziție ereditară la leucemie și rezistență la terapia medicamentoasă pentru această boală. .

Produsul genei CYP1A2 metabolizează numai HAP, dar și compuși precum cofeina, teofilina etc. S-a demonstrat că prezența alelei *1A a genei CYP1A2 inhibă metabolismul unor medicamente precum cafeina, deazepamul, verapamilul, metadona, teofilina, estradiol.

Familia P-450 CYP2 este reprezentată de un grup de enzime cele mai semnificative din punct de vedere funcțional care metabolizează un număr mare de medicamente diferite. Activitatea lor arată o dependență pronunțată de polimorfismul genetic.

Subfamilia CYP2A este cea mai importantă izoenzimă a acestei subfamilii. Este implicat în conversia nicotinei în cotinină, în hidroxilarea cumarinei și ciclofosamidei și contribuie la metabolismul ritonavirului, paracetamolului și acidului valproic. CYP2A6 este implicat în bioactivarea componentelor fumului de tutun - nitrozaminele, care provoacă cancer pulmonar. Gena CYP1A6 este localizată pe cromozomul 19 la locusul 19q13.2. Gena este exprimată în principal în ficat. S-a demonstrat că alela *4 a genei CYP1A6 este protectoare, adică este asociată cu un risc mai scăzut de cancer pulmonar. Prezența alelelor *2 și *3 este asociată cu un metabolism redus al cumarinei, ceea ce este important atunci când se administrează acest medicament din cauza posibilei hepatotoxicități.

subfamilia CYP2B. Toate enzimele din această subfamilie sunt induse de fenobarbital. Cea mai semnificativă enzimă este CYP2B6, care metabolizează multe medicamente citotoxice (ciclofosfamidă), antivirale (efavirenz și nevirapină), antidepresive (bupropion), anestezice (propofol) și opioide sintetice (metadona) și este, de asemenea, implicată în metabolismul steroizilor endogeni. Gena CYP2B6 este localizată în același locus ca și gena CYP2A6 și este exprimată predominant în ficat. Prezența alelelor lente ale genei CYP2B6 (*2, *4, *5, *6) reduce rata de metabolizare a medicamentelor antivirale, ceea ce duce la scăderea clearance-ului și crește riscul de complicații ale sistemului nervos central.

Subfamilia CYP2C joacă un rol cheie în metabolismul multor medicamente. O proprietate comună a acestor izoenzime este prezența activității 4-hidrolazei împotriva medicamentului anticonvulsivant mefenitoină.

Deosebit de important pentru farmacogenetica clinică este testarea polimorfismului genei CYP2C9 situată în locusul 10q24. Gena este exprimată predominant în ficat și este principalul metabolizator al inhibitorilor receptorilor de angiotensină (losartan și irbersartan). Substratele sale includ și anticoagulante (warfarină), medicamente pentru scăderea glicemiei (glipizidă), anticonvulsivante (fenitoină, diazepam), antidepresive (amitriptilină, clomipramină, imipramină), inhibitori ai pompei de protoni (omeprazol), antiinflamatoare nesteroidiene (diclofenac, ibuprofen, piroxicam), tolbutamina. După cum sa menționat, analiza polimorfismului genei CYP2C9 a fost primul test genetic aprobat oficial (vezi mai sus). Numărul de indivizi cu activitate redusă a acestei enzime în populația domestică este de până la 20%. În același timp, pentru a evita efectele secundare nedorite, doza terapeutică a medicamentelor de mai sus la purtătorii alelelor *2 și *3 ale genei CYP2C9 trebuie redusă de 2-4 ori.

Gena CYP2C19 este localizată în locusul 10q24.1-q24.3 și este exprimată în ficat. Produsul său proteic este principala enzimă în metabolismul inhibitorilor pompei de protoni (omeprazol) și anticonvulsivante (proguanil, acid valproic, diazepam, barbiturice). Frecvența alelei sale „lente” (*2) în populația europeană variază de la 5 la 200%.

subfamilia CYP2D. Citocromul CYP2D6 metabolizează aproximativ 20% din toate medicamentele cunoscute. Gena CYP2D6 este localizată pe cromozomul 22 la locusul 22q13.1. Sediul principal al expresiei sale este ficatul. În prezent, în gena CYP2D6 au fost identificate peste 36 de alele, unele dintre ele fiind caracterizate prin absența unui produs proteic, în timp ce altele duc la apariția unei enzime cu proprietăți modificate. Substraturile enzimei CYP2D6 sunt medicamente utilizate pe scară largă în practica clinică, cum ar fi beta-blocante, antidepresive, substanțe antipsihotrope, antiaritmice, antipsihotice, medicamente antihipertensive, inhibitori de monooxid reductază, derivați de morfină, neurotransmițători (dopamine), analgezice opiacee. Ținând cont de faptul că aproximativ 6-10% dintre caucazieni sunt metabolizatori lenți ai acestei enzime, există o nevoie evidentă de testare genetică a CYP2D6 pentru a ajusta dozele acestor medicamente. În plus, alelele „slăbite funcțional” ale acestei gene sunt asociate cu o predispoziție ereditară la boli atât de grave precum cancerul pulmonar, cancerul intestinal etc.

subfamilia CYP2E. Citocromul CYP2E1 este o enzimă inductabilă de etanolină. Substraturile sale sunt tetraclorura de carbon, dimetilnitrozamina. Există dovezi că CYP2E1, împreună cu CYP1A2, este implicat în conversia paracetamolului în N-acetilbenzochinonimină, care are un efect hepatotoxic puternic. În plus, este cea mai importantă izoenzimă a grupului de citocromi care oxidează colesterolul cu lipoproteine ​​cu densitate joasă, care, la rândul său, duce la formarea plăcilor aterosclerotice. Gena CYP2E1 este localizată la locusul 10q24.3-qter și este exprimată în ficatul oamenilor adulți. Polimorfismul Taq1 în gena CYP2E1 duce la o scădere a activității acestei enzime. Homozigoții M/M pentru alela slăbită a genei CYP2E1 prezintă o sensibilitate crescută la medicamentele de mai sus datorită detoxificării întârziate.

Familia citocromului P-450 CYP3

Subfamilia CYP3A este cea mai numeroasă. Reprezintă aproximativ 30% din toate izoenzimele citocromului P-450 din ficat și 70% din toate izoenzimele din peretele tractului gastrointestinal. Cele mai semnificative enzime sunt CYP3A4 și CYP3A5, ale căror gene sunt localizate în locusul 7q22.1. Gena CYP3A4 este exprimată predominant în ficat, iar CYP3A5 în tractul gastrointestinal.

Enzima CYP3A4 metabolizează peste 60% din toate medicamentele și joacă un rol major în metabolismul testosteronului și estrogenilor. Variantele alelice ale genei CYP3A4 sunt foarte numeroase, dar datele privind efectul lor asupra farmacocineticii medicamentelor corespunzătoare sunt contradictorii.

Enzima CYP3A5 metabolizează unele dintre medicamentele cu care interacționează CYP3A4. S-a demonstrat că prezența alelei *3 a genei CYP3A5 duce la o scădere a clearance-ului medicamentelor precum alprazalam, midazolam și saquinavir.

Paraoxonaza este o enzimă responsabilă de sinteza paraoxonazei, o proteină plasmatică a sângelui. În plus, enzima inactivează compușii organofosforici, organofosfații, carbamații și esterii acidului acetic. Unele dintre aceste substanțe sunt agenți de război chimic - sarin, soman, tabun. Dintre cele trei izoforme cunoscute, enzima PON1 este cea mai importantă. Gena sa este localizată la locusul 7q21.3. Cel mai semnificativ și mai studiat polimorfism este înlocuirea glutaminei cu arginină la poziția 192 (polimorfismul L/M). S-a demonstrat că alela M este asociată cu metabolismul redus al compușilor organofosforici.

Alela M și genotipul M/M cresc riscul de a dezvolta boala Parkinson, în special în combinație cu alela 5 a genei GSTP1, și sunt asociate cu formarea plăcilor aterosclerotice.

Alcool și aldehide dehidrogenaze

Alcool dehidrogenaza este o enzimă cheie în catabolismul etanolului și al altor alcooli, oxidând alcoolii la aldehide. La adulți, gena ADH1B este exprimată în ficat. Există o anumită dinamică a nivelului său de expresie în funcție de vârstă. Gena ADH1B (ADH2) este localizată la locusul 4q22. Cel mai studiat polimorfism este G141A. S-a demonstrat că alela A este asociată cu creșterea activității enzimatice, ceea ce duce la acumularea excesivă de produse metabolice intermediare - aldehide, care au un efect toxic pronunțat. Persoanele cu alela A a genei ADH1B au o sensibilitate crescută la etanol și sunt mai puțin susceptibile la alcoolism.

Există, de asemenea, două aldehide dehidrogenaze prezente în celulele hepatice: ALDH1 (citosolică) și ALDH2 (mitocondrială). Gena ALDH2 este localizată în locusul 12q24.2, produsul său joacă un rol cheie în conversia aldehidelor toxice în acizii carboxilici corespunzători, care sunt ușor îndepărtați din organism. ALDH2 joacă un rol important în catabolismul alcoolului. Se știe că printre reprezentanții rasei galbene, intoxicația cu alcool este cauzată de absența ALDH2 la aproape 50% din populație. Polimorfismul în gena ALDH2 are ca rezultat înlocuirea Glu la poziția 487 a proteinei (alela ALDH2*1) cu Lys (alela ALDH2*2). Alela ALDH2*2 codifică o enzimă cu activitate redusă. La heterozigoți, activitatea enzimatică este redusă de 10 ori. Enzima ALDH2 este implicată în patogeneza diferitelor tipuri de cancer asociate cu consumul excesiv de alcool - carcinom hepatocelular, cancer de esofag, faringe și cavitate bucală.

Consumul intensiv de alcool la indivizii cu variante alelice nefavorabile ale genelor ADH1B și ALDH2 poate duce la dezvoltarea rapidă a complicațiilor hepatice: boala alcoolică și ciroza hepatică.

Citocromul P450 familia 2 subfamilia C polipeptida 9 (CYP2C9). Detectarea mutației A1075C (Ile359Leu).

Numele genei -CYP2C9

Localizarea genei pe cromozom– 10q23.33

• *1/*1
• *1/*3
• *3/*3

Apariția în populație

Alela CYP2C9*3 apare la europeni cu o frecventa de 6%.

Asocierea markerului cu metabolismul medicamentului

Se studiază pentru a determina eficacitatea fiziologică a utilizării medicamentelor: anticoagulante orale din clasa cumarinelor (warfarină), derivați de sulfoniluree, analgezice nenarcotice (tenoxicam, flurbiprofen, lornoxicam, piroxicam), losartan și irbesartan (blocante ale receptorilor angiotensinei II). ).

Informații generale despre studiu

Medicamentul cel mai frecvent utilizat pentru prevenirea și tratarea complicațiilor tromboembolice este warfarina (Coumadin). Este prescris pentru utilizare pe termen lung într-o serie de cazuri asociate cu creșterea coagulării sângelui, precum și în perioada postoperatorie pentru a preveni formarea cheagurilor de sânge din cauza intervenției chirurgicale. Deseori se practică prescrierea medicamentului persoanelor care au suferit accidente vasculare cerebrale sau infarct miocardic.

Pentru a obține efectul medicamentelor, este necesară bioactivarea lor în organism (transformarea într-o formă activă) în celulele hepatice (hepatocite) de către sistemul enzimatic al citocromului P450 (CYP). Genele care codifică aceste enzime sunt polimorfe, iar alelele care codifică formarea de enzime cu funcție redusă sau absentă sunt adesea găsite.

Activitatea citocromilor, pe lângă caracteristicile structurale ale genelor care le codifică, este influențată de factori precum vârsta, greutatea corporală, stilul de viață, obiceiurile proaste, dieta, bolile concomitente și medicamentele. Acești factori sunt responsabili pentru formarea caracteristicilor individuale ale activității enzimelor P450 și determină natura metabolismului majorității medicamentelor. Principala enzimă pentru biotransformarea anticoagulantelor indirecte este izoenzima citocromului P450. CYP2C9.

Gene CYP2C9 localizat pe cromozomul 10 în regiunea 10q23.33. Există variante ale genelor (alele) CYP2C9, care codifică formarea unei enzime cu funcție redusă sau absentă. Varianta de genă care poartă o substituție punctuală a adeninei cu citozină la poziția 1075 (A1075C) duce la o scădere a activității metabolice a enzimei și este denumită CYP2C9*3. O singură substituție de nucleotidă are ca rezultat o substituție a aminoacidului izoleucină cu leucină (Ile359Leu) în enzima CYP2C9. Astfel, se sintetizează o enzimă cu o funcție alterată, a cărei activitate este mai mică de 5% din activitatea enzimei *1. Varianta majoră (neschimbată) a genei este desemnată ca CYP2C9*1.

Genotipul cel mai frecvent determină metabolismul normal al warfarinei și este desemnat CYP2C9 *1/*1.

Marker genetic CYP2C9*3(genotipurile *3/*3 și *3/*1) este asociată cu o modificare a activității funcționale a enzimei citocromului P450, care reduce rata de eliminare a warfarinei din organism. Prezența alelei *3 la un pacient duce la o scădere semnificativă a activității izoenzimei citocromului, ceea ce crește efectul anticoagulant al medicamentelor de până la 7 ori și poate provoca dezvoltarea unor complicații precum sângerare internă extinsă și episoade de hipocoagulare excesivă.

Citocromii P450. Structură și funcție

Printre enzimele de faza 1, locul principal este ocupat de sistemul citocromului P450 (P450 sau CYP) în ceea ce privește activitatea catalitică față de un număr mare de xenobiotice. Cea mai mare concentrație de citocrom P450 se găsește în reticulul endoplasmatic al hepatocitelor (microzomi). Citocromii microzomali hepatici P450 joacă un rol critic în determinarea intensității și timpului de acțiune a compușilor străini și un rol cheie în detoxifierea xenobioticelor, precum și în activarea acestora la metaboliți toxici și/sau cancerigeni. Monooxigenazele dependente de citocrom P450 sunt un sistem de transport de electroni multienzimatic. Toți citocromii P450 sunt proteine ​​care conțin hem. Fierul hem este de obicei în stare oxidată (Fe3+). Fiind redus la starea Fe2+, citocromul P450 este capabil să lege liganzi precum oxigenul sau monoxidul de carbon. Complexul de citocrom P450 redus cu CO are un maxim de absorbție la 450 nm, care a stat la baza pentru

denumirile acestor enzime. Reacția principală catalizată de citocromii P450 este o reacție monooxigenază, în care un atom de oxigen interacționează cu substratul (RH), iar celălalt este redus la H2O. NADPH participă ca agent reducător în reacția:

RH (substrat) + O2 + NADPH + H+ --> ROH (produs) + H2O + NADP+

Mecanismul prin care citocromul primește un electron de la NADPH depinde de localizarea intracelulară a citocromului P450. În ER, unde se află majoritatea hemoproteinelor implicate în biotransformarea xenobioticelor, electronul este transferat printr-o flavoproteină numită NADPH-P450 reductază. O moleculă de reductază poate livra electroni la mai multe molecule P450 diferite. În mitocondrii, unde se află itocromii P450 implicați în biosinteza hormonilor steroizi și în metabolismul vitaminei D, electronul este transferat folosind 2 proteine: ferodoxină sau ferodoxin reductază.

În fig. Figura 1 prezintă ciclul catalitic al citocromului P450. Prima parte a ciclului implică activarea oxigenului, a doua – oxidarea substratului. Mecanismul de acțiune al sistemului monooxigenază microzomal a fost descris pentru prima dată de Estabrook și colab., iar acum a fost confirmat de mulți cercetători. Această schemă este următoarea: prima etapă constă în interacțiunea substratului cu forma oxidată a P450. Când P450 se leagă de substraturi

Există o tranziție a fierului hem de la o stare de spin scăzut la o stare de rotație înaltă. A doua etapă constă în reducerea complexului enzimă-substrat rezultat cu primul electron, care provine din lanțul de transfer specific NADPH de la NADPH prin

flavoproteina I (NADPH-citocrom P450 reductază). A treia etapă constă în formarea unui complex ternar: citocrom P450 redus-substrat-oxigen. Etapa a patra

reprezintă reducerea unui complex ternar cu un al doilea electron, care, ca

se crede că provine din lanțul de transport de electroni specific NADH, constând din NADH-

citocromul b5 reductaza sau flavoproteina II și citocromul b5. A cincea etapă constă din mai multe procese, inclusiv transformări intramoleculare ale complexului ternar redus și descompunerea acestuia cu formarea unui produs hidroxilat și a apei. În această etapă, citocromul P450 se transformă în forma sa originală oxidată.

Citocromii P450 catalizează următoarele tipuri de reacții: hidroxilarea unui atom de carbon alifatic sau aromatic; epoxidarea dublei legături;

oxidarea atomului (S, N, I) sau N-hidroxilare; transferul grupării oxidate;

distrugerea comunicării eterice; dehidrogenare. Unele reacții catalizate

citocromul P450 sunt prezentate în Fig. 2 și 3. Mai multe clase de reactivi sunt bune

Ultimul carbon din lanț este hidroxilat, așa-numita omega-hidroxilare. Asa de

hidroxilarea internă are loc în mai multe poziții (pozițiile -1,- 2).

Acest lucru are ca rezultat multe variații diferite de produs chiar și cu un alcan simplu, cum ar fi hexanul. Rețineți că hidrocarburile ciclice suferă și hidroxilare. În reacția de hidroxilare, se formează mai întâi un hemiacetal, care este apoi transformat într-un alcool și o aldehidă. Când alchenele sunt oxidate de citocromul P450, se formează oxizi diatomici. Ele variază în ceea ce privește stabilitatea și pot fi foarte reactive. De exemplu, clorura de vinil este transformată metabolic într-un oxid, care apoi se transformă în cloroacetaldehidă, un mutagen care acționează direct asupra ADN-ului. Aceste studii au condus la interzicerea utilizării clorurii de vinil în nebulizatoare. Grupul vinilic al sterolului (vinilbenzen) este cunoscut pentru proprietățile sale cancerigene, dar corpul uman este capabil să-l neutralizeze transformând oxidul într-un diol folosind enzima epoxihidrolază. Dar epoxihidrolaza nu ajută întotdeauna. De exemplu, citocromul P450 sintetizează epoxidul Aflotoxin B1 in vivo. Acest compus este un electrofil foarte reactiv, este instabil și formează rapid un aduct cu ADN. În plus, diolul format din epoxid este, de asemenea, instabil și foarte reactiv. Oxidarea compușilor aromatici cu citocromul P450 produce și epoxizi, dar se transformă rapid în fenol. Ca urmare a hidroxilării benzenului, fenolul rezultat poate fi hidroxilat din nou, transformându-se în catecol sau hidrochinonă. Rețineți că catecolul și hidrochinona pot reacționa cu oxigenul, inhibând reacții similare cu chinone și superoxizi, care sunt toxine. Un astfel de compus binecunoscut precum 2,3,7,8-tetraclorodibenzendioxina (TCDD) nu este susceptibil la hidroxilare și este stabil (timp de înjumătățire în corpul uman este de un an sau mai mult).