염색체 질환의 진단에서 제자리 형광 혼성화 방법(FISH). 형광 혼성화 형광 혼성화

• Fluorescence in situ hybridization, 또는 FISH 방법(fluorescence in situ hybridization - FISH)은 중기 염색체 또는 in situ 핵에서 특정 DNA 서열의 위치를 ​​감지하고 결정하는 데 사용되는 세포유전학적 방법입니다. 또한 FISH는 조직 샘플에서 특정 mRNA를 감지하는 데 사용됩니다. 후자의 경우, FISH 방법을 사용하면 세포 및 조직에서 유전자 발현의 시공간적 특징을 확립할 수 있습니다.

  FISH 방법은 착상 전, 산전 및 산후 유전 진단, 종양 질환 진단, 후향적 생물학적 선량 측정에 사용됩니다.

관련 개념

소핵 - 세포학에서 생존에 필요한 완전한 게놈을 포함하지 않는 진핵 세포의 핵 조각. 그것은 병리학 적 구조이며 모든 조직의 세포에서 관찰 될 수 있습니다. 일반적으로 소핵은 세포 사멸 동안 비정상적인 세포 분열 또는 핵 분열의 결과로 형성됩니다.

상동 재조합 또는 일반 재조합은 뉴클레오티드 서열이 2개의 유사하거나 동일한 염색체 사이에서 교환되는 유전적 재조합의 한 유형입니다. 이것은 이중 또는 단일 가닥 DNA 손상을 복구하기 위해 세포에서 가장 널리 사용되는 방법입니다. 상동 재조합은 또한 감수 분열 동안 다양한 유전자 조합을 만들어 높은 수준의 유전적 다양성을 제공하여 인구가 더 잘 적응할 수 있도록 합니다.

코스미드(Cosmides) - cos-site를 포함하는 람다 파지의 DNA 단편을 포함하는 플라스미드. 체외에서 파지 입자의 패키징 시스템과 함께 이들은 유전자 복제 및 게놈 라이브러리 구축을 위한 벡터 분자로 사용됩니다. Cosmids는 1978년 Collins와 Brüning에 의해 처음 만들어졌습니다. 그들의 이름은 cos-section(용어 자체는 차례로 영어 cohesive end-sticky end에서 유래)과 플라스미드의 두 가지 용어의 약어에서 비롯됩니다.

유전자 염기서열에 대한 방대한 정보의 축적으로 인해, 현재 역유전학 방법은 유전자의 기능을 확인하는 데 자주 사용됩니다. 연구원들은 유전자 서열을 조작하여 특정 유전자를 변경하거나 차단하고 이것이 어떤 변화를 가져오는지 분석합니다. 이것은 역유전학의 경로입니다: 유전자에서 형질/표현형으로. 정방향 및 역방향 유전학은 상호 배타적인 접근 방식이 아니라 유전자 기능 연구에서 서로를 보완합니다.
(eng. 변형) - 박테리아 세포가 외부 환경에서 DNA 분자를 흡수하는 과정. 형질전환이 가능하려면 세포가 유능해야 합니다. 즉, DNA 분자가 세포막을 통해 세포 안으로 침투할 수 있어야 합니다. 변환은 분자 생물학 및 유전 공학에서 활발히 사용됩니다.

비-상동 말단 연결 또는 비-상동 말단 연결(NHEJ)은 DNA의 이중 가닥 파손을 복구하는 방법 중 하나입니다. 이 과정은 상동 재조합 과정과 달리 상동 주형이 필요 없이 사슬의 손상된 말단이 리가아제에 의해 직접 연결되기 때문에 비 상동이라고 합니다. "비상동 말단 접합"이라는 용어는 1996년 Moore와 Haber에 의해 제안되었습니다. NHEJ는 상동 재조합보다 훨씬 덜 정확합니다...

Cullins는 유비퀴틴 리가아제(E3)의 스캐폴드 역할을 하는 소수성 단백질 계열입니다. 모든 진핵생물은 컬린을 가지고 있는 것으로 보입니다. 이들은 RING 단백질과 함께 culin-RING 유비퀴틴 리가제(CRL)를 형성하는데, 이는 매우 다양하고 많은 세포 과정, 예를 들어 단백질 분해(세포 단백질의 약 20% 파괴), 후성 유전적 조절 및 살리실산이 매개하는 식물 면역..

NGS(Next Generation Sequencing)는 DNA와 RNA의 염기서열을 결정하여 1차 구조에 대한 형식적인 설명을 얻는 기술입니다. 차세대 시퀀싱 방법(NGS) 기술을 사용하면 게놈의 여러 섹션을 한 번에 "읽을 수" 있는데 이것이 이전 시퀀싱 방법과의 주요 차이점입니다. SNP는 중합효소에 의해 유도된 사슬 연장 또는 다중 ...

Quantiferon(간혹 quantiferon, quantiferon test; English QuantiFERON)은 미국 회사 QIAGEN에서 제조한 결핵 감염에 대한 효소 면역 분석 진단 테스트의 상품명입니다. Text는 ELISA 기술을 사용하여 면역 반응 인터페론 감마를 감지합니다.

혼성화 방법 현장* (in place, lat.) 고정 염색체 및 간기 핵의 준비에 직접 DNA/RNA 프로브를 사용하여 안정적인 하이브리드 분자를 형성하는 DNA 또는 RNA의 능력을 기반으로 합니다. 이 방법을 사용하면 세포, 세포 핵 또는 염색체에서 거의 모든 DNA 또는 RNA 서열의 정확한 위치를 직접 결정할 수 있습니다.

교잡을 위해. 현장에서표준 방법에 따라 제조된 모든 조직 또는 기관의 세포에 대한 적절한 세포학적 또는 조직학적 제제. 임상 세포 유전학 실험실에서는 배양된 말초 혈액 림프구, 융모막 상피 세포영양막 세포, 양수의 배양 및 미배양 세포, 낙태 물질의 다양한 조직, 협측 상피 및 혈액 세포의 도말이 사용됩니다.

혼성화 방법 현장에서 비방사성 변형된 뉴클레오티드로 표지된 프로브의 사용을 기반으로 한 비동위원소 변이체의 개발로 인해 실제 세포 유전학에 특히 중요합니다. 조제물에 대한 혼성화의 비-동위원소 변이체(특히 형광성 변이체)는 동위 원소에 비해 여러 가지 장점이 있습니다. 건강 연구원을 위한 속도와 안전

또한, 다른 검출 시스템을 사용하여 검출된 다르게 변형된 프로브의 조합을 통해 하나의 세포 또는 하나의 중기 플레이트에서 둘 이상의 DNA 서열의 위치를 ​​동시에 결정할 수 있습니다. 그리고 DNA 프로브로 형광색소로 표지된 반복적인 서열을 사용하면 절차 시간이 7-9시간으로 단축됩니다(고전적인 비 동위원소 혼성화는 이틀, 동위원소 변이체는 1주일에서 한 달로 소요). 이는 특히 산전 진단에 중요합니다. 용법 물고기 방법세포 유전 진단에서 구조적 염색체 재배열을 식별하고 마커 염색체의 특성을 확립하며 중기 염색체와 간기 핵 모두에서 염색체 세트의 수치 위반을 분석할 수 있습니다.

FISH 방식의 원리

중심에서 물고기 방법인공적으로 생성된 DNA 프로브와 핵 DNA의 상보적인 뉴클레오티드 서열 사이의 혼성화 반응이 있습니다. DNA 분자는 두 개의 나선 뉴클레오티드 사슬로 구성되어 있으며 사슬이 분리되어야만 교잡이 가능합니다. DNA의 뉴클레오티드 사슬을 분리하기 위해 변성이 사용됩니다(이후 혼성화를 위해서는 연구 중인 샘플의 핵에 있는 DNA와 DNA 프로브 자체가 모두 변성되어야 합니다). 변성 후, DNA 프로브는 상보적인 뉴클레오티드 서열에 혼성화되고 형광 현미경을 사용하여 검출할 수 있습니다.

따라서 설정을 위한 프로토콜의 일반적인 형태는 생선다음과 같은 형식으로 제시할 수 있습니다.

1. 조직학적 또는 세포학적 제제의 준비.
조직 학적 준비의 준비는 절단, 마킹, 배선, 붓기, 미세 절개, 유리 슬라이드에 절단 배치 및 파라핀 제거와 같은 표준 계획에 따라 수행됩니다. 세포 학적 제제를 준비 할 때 특수 침전 용액과 원심 분리가 사용되어 농축 된 세포 현탁액을 얻을 수 있습니다.

2. 전처리(필요한 경우).
조제물은 혼성화를 방해하는 단백질의 존재를 제거하기 위해 프로테아제에 의해 처리됩니다.

3. 준비 및 후속 변성에 DNA 프로브를 적용합니다.
프로브와 샘플 DNA를 변성시키기 위해 포름아미드를 처리하고 약 85-90°C의 온도로 가열합니다.

4. 혼성화.
변성 후, 약물은 특정 온도(임상 연구의 경우 37°C)로 냉각되고 습한 챔버에서 몇 시간 동안 배양됩니다(인큐베이션 기간은 각 특정 프로토콜에 표시됨). 현재, 자동 혼성화기는 변성 및 혼성화에 사용된다.

5. 세척.
하이브리드화가 완료되면 결합되지 않은 프로브를 씻어내야 하며, 그렇지 않으면 FISH 결과를 평가하기 어렵게 만드는 배경이 생성됩니다. 플러싱에는 일반적으로 시트르산과 염화나트륨(SSC)이 포함된 용액이 사용됩니다.

6. 반대 염색.
형광 염료(DAPI - 4,6-diamidin-2-phenylindole; propidium iodide)의 도움으로 모든 핵 DNA가 염색됩니다.

7. 형광현미경을 이용한 결과 분석. 일상적인 작업(탈납, 전처리, 세척)을 자동화할 수 있습니다.

* - 자료는 오픈소스 정보를 바탕으로 작성되었습니다.

핵산의 제자리 혼성화 방법은 단일 가닥 서열(리보 또는 데옥시리보, 올리고 또는 폴리뉴클레오티드)을 기반으로 인공적으로 생성된 표지된 프로브와 이들에 상보적인 서열 사이에 이중 가닥 하이브리드를 형성할 가능성을 기반으로 합니다. 표적 - 분석된 DNA 또는 RNA 분자. 혼성화 부위를 식별하기 위해 DNA 프로브(DNA 프로브)는 리포터 그룹으로 표지됩니다. 등.

프로브에서 리포터 그룹의 존재로 인한 잡종을 검출함으로써, - 특정 유형의 RNA를 코딩하는 유전자의 수를 추정하고, - 게놈에서 전사되지 않은 DNA의 비율을 결정하고, - 확립하는 것이 가능하다 특정 유전자의 서로 연결 및 염색체상의 정확한 위치. 분자 혼성화 방법은 높은 감도(소량의 표지된 프로브(10 -15 및 10 -19 M) 및 이에 따라 표적에서 상보적인 서열을 검출할 수 있음) 및 분석 속도가 있어 이 방법을 연구에 모두 사용할 수 있습니다. 활동 및 의학, 수의학 및 작물 생산의 유전 및 전염병 진단을 위한 것입니다.

주로 핵산의 제자리 교잡을 기반으로 하는 분자 세포 유전학의 새로운 기술의 출현은 염색체 진단의 가능성을 크게 확장했습니다.

간기 세포유전학: 1. 다색 염색체 밴딩(MCB). 2. 형광 제자리 혼성화(FISH). 3. FISH와 다른 방법의 조합: -세포학 + FISH; -조직학 + 물고기; -면역표현형 + 물고기(FICTION); 중기 세포 유전학: 1. 염색체의 단단한 염색(전체 그림). 2. 비교 게놈 혼성화(CGH). 3. 색상 변경 핵형(CCK). 4. 다색 핵형 분석: 스펙트럼 핵형 분석(SKY); 여러 가지 빛깔의 물고기(M - 물고기, M - 밴드).

FISH(형광 제자리 혼성화)는 염색체, mRNA 등에 있는 특정 DNA 서열의 검출 및 위치 파악에 사용되는 세포유전학적 방법입니다. 이 기술은 형광 표지된 DNA/RNA 프로브와 상보적 DNA/RNA 서열의 혼성화를 기반으로 합니다. 라벨은 형광 현미경을 사용하여 감지됩니다. FISH 방법은 30년 전에 도입되었습니다. 염색체에 유전자를 물리적으로 매핑하는 방법으로 널리 보급되었습니다. 나중에 그것은 다른 연구 영역(임상 유전학, 생식 의학, 독성학, 진화 생물학, 비교 및 ​​세포 유전체학, 염색체 생물학 분야)에 적용되었습니다. 현재 FISH는 염색체의 물리적 및 유전적 지도를 구축하고 구조적 재배열, 전위, 미세결실, 간기 및 중기 염색체의 유전자 증폭을 감지하는 데 주로 사용됩니다. 과학의 발전(핵산 및 염색질의 화학적 및 물리적 특성에 대한 더 나은 이해)과 형광 현미경 및 디지털 이미징의 발전으로 인해 방법이 지속적으로 개선되었습니다(감도, 특이성, 분해능 개선). 이 방법의 많은 변형이 개발되었습니다.

1) 세포를 유리 슬라이드에 떨어뜨려 염색체가 퍼지도록 합니다. 4) 염색체를 DAPI를 사용하여 반대 염색합니다. 2) 형광 표지된 프로브를 염색체에 놓고 밀봉합니다. 3) 프로브와 염색체를 변성, 혼성화 후 세척 5) 슬라이드를 형광현미경으로 관찰

FISH를 설정하기 위한 프로토콜의 일반적인 형태는 다음과 같이 나타낼 수 있습니다. 1. 조직학적 또는 세포학적 표본의 준비. 조직 학적 준비의 준비는 절단, 마킹, 배선, 붓기, 미세 절개, 유리 슬라이드에 절단 배치 및 파라핀 제거와 같은 표준 계획에 따라 수행됩니다. 세포 학적 제제를 준비 할 때 특수 침전 용액과 원심 분리가 사용되어 농축 된 세포 현탁액을 얻을 수 있습니다. 2. 전처리(필요한 경우). 조제물은 혼성화를 방해하는 단백질의 존재를 제거하기 위해 프로테아제에 의해 처리됩니다. 3. 준비 및 후속 변성에 DNA 프로브를 적용합니다. 프로브와 샘플 DNA를 변성시키기 위해 포름아미드를 처리하고 약 85-900C의 온도로 가열합니다.

4. 하이브리드화. 변성 후, 약물은 특정 온도(임상 연구의 경우 370C)로 냉각되고 습한 챔버에서 몇 시간 동안 배양됩니다(인큐베이션 기간은 각 특정 프로토콜에 표시됨). 현재, 자동 혼성화기는 변성 및 혼성화에 사용된다. 5. 세척. 하이브리드화가 완료되면 결합되지 않은 프로브를 씻어내야 하며, 그렇지 않으면 FISH 결과를 평가하기 어렵게 만드는 배경이 생성됩니다. 플러싱에는 일반적으로 시트르산과 염화나트륨(SSC)이 포함된 용액이 사용됩니다. 6. 반대 염색. 형광 염료(DAPI - 4, 6-diamidin-2 phenylindole; propidium iodide)의 도움으로 모든 핵 DNA가 염색됩니다. 7. 형광현미경을 이용한 결과 분석 일상적인 작업(탈납, 전처리, 세척)을 자동화할 수 있습니다.

형광 현미경을 사용하여 텔로머 영역의 검사. 간기(핵) 및 중기(개별 염색체) 단계에서 얻은 이미지를 결합합니다. 파란색 - DAPI.

FISH 방법의 장점: 1. 간기 핵의 유전 물질 연구 가능성; 2. 예/아니오 기준으로 객관적인 결과를 얻는 것은 정량적 방법입니다. 3. 결과에 대한 비교적 간단한 해석, 고해상도 FISH 방법의 단점: 1. 형광 염료가 빨리 "바램", 현미경입니다.

FISH 방법은 제한된 크기의 뉴클레오티드 서열인 특수 기술을 사용하여 생성된 DNA 프로브와 연구 중인 세포유전학적 제제의 핵 DNA의 상보적 섹션 간의 하이브리드화 반응을 기반으로 합니다. DNA 프로브는 FISH를 설정하기 위한 주요 요소이며 "라벨"을 가지고 있습니다. 즉, 형광색을 운반하는 항체에 의한 추가 시각화를 위해 형광색 또는 합텐에 직접 연결된 뉴클레오티드를 포함합니다. 결합되지 않은 표지된 DNA를 세척한 다음 형광 현미경을 사용하여 혼성화된 DNA 프로브를 검출합니다.

DNA 라벨링은 직접 및 간접으로 나뉩니다. 직접 라벨링은 리포터 요소를 DNA - 형광색소(로다민, 디에틸아미노쿠마린, 텍사스 레드 등)에 도입합니다. 간접 표지 방법 - DNA 샘플은 중간 리간드(비오틴, 디옥시게닌, 2,4-디니트로페놀)와 사전 접합되며, 세포학적 제제 상의 존재는 형광색소를 사용하여 감지됩니다. 이 경우 리간드가 형광색소와 상호작용하는 여러 부위를 포함할 수 있기 때문에 방법의 감도가 크게 증가합니다. 32P-표지된 프로브를 사용한 제자리 혼성화는 1969년에 처음 기술되었습니다. DNA 프로브의 라벨링 및 검출을 위한 비방사성 시스템의 개발은 제자리 혼성화 방법을 안전하고 수행하기 쉬우며 결과를 처리하는 데 덜 힘들게 만들었습니다. 형광 염료는 부드럽고 사용하기 쉬우며 무기한 저장할 수 있으며 고해상도를 제공하며 여러 DNA 서열을 동시에 검사할 수 있습니다.

프로브: 단일 가닥/이중 가닥 DNA/RNA 1차/2차 표지된 프로브. 프로브는 1) 직접: 형광 표지된 항체가 부착된 리포터 분자(예: 디곡시제닌, 비오틴)를 통해 형광색소가 부착된 뉴클레오티드를 삽입하여(PCR 또는 닉 번역) 2) 리포터 분자를 통해 표지됩니다. 신호를 강화하기 위해 형광 라벨로 표시된 2차, 3차 등의 항체를 사용할 수 있습니다. DNase nicks DNA Nick Translation DNA 중합효소 I은 3' 하이드록실 DNA 중합효소에 새로운 뉴클레오티드를 추가합니다. I은 DAPI(2 mg/ml)를 사용하여 5' 말단 염색체 이미징에서 개별 염기를 제거합니다. 4',6-디아미디노-2-페닐인돌; A-T가 풍부한 DNA 영역에 대한 강한 결합; UV 광에 의한 여기; 방출 461 nm(파란색).

현재, 현대 분자 세포 유전학에서 널리 사용되는 몇 가지 주요 접근 방식이 있습니다. 확장된 염색체 영역 및 전체 염색체의 물질 식별. 특정 DNA 서열의 관심 영역에서 검출. 개별 염색체 영역의 불균형 분석. 확장된 염색체 영역과 전체 염색체의 물질을 식별하기 위해 염색체 특이적 및 영역 특이적 DNA 프로브("페인팅 프로브")가 널리 사용됩니다.

다양한 프로브 유형의 특성 1. 유전자좌 특이적 프로브(LSI - locus - 염색체의 특정 영역에 결합하는 특정 식별자) 이러한 프로브는 사용 가능한 단리된 DNA의 짧은(비반복) 서열을 식별하는 데 사용됩니다. 표지된 프로브를 준비하고 염색체 세트와의 후속 하이브리드화. 이들은 다양한 병리학적 조건(개별 염색체에 대한 단염색체 및 삼염색체)에서 진단 및 예후적으로 유의한 염색체 이상을 감지하도록 설계되었습니다. 이 샘플의 가장 광범위한 사용은 산전 세포유전학적 진단, 특히 융모막 조직 세포 및 양수 세포의 간기 핵 연구에서 얻어졌습니다.

2. 염색체의 텔로머 영역에 대한 DNA 프로브(TEL telomericprobe)는 염색체 팔의 말단 영역에 영향을 미치는 결실 및 재배열을 감지하도록 설계되었습니다. 이러한 프로브는 염색체의 p-암 또는 q-암에 특이적이며 약 300kb 길이의 영역에 상보적입니다. 염색체의 끝에서. 일반적으로 염색체의 짧은 팔과 긴 팔에 대한 DNA 프로브는 서로 다른 형광색소와 연관되어 있어 하나의 세포유전학적 제제에서 염색체의 텔로머 영역을 모두 감지할 수 있습니다.

3. 중심체 반복 프로브, 알파 또는 염색체 분자(CEP - centromere. Enumeration. Probe)는 탠덤 알파 및 베타 위성 반복 시퀀스로 표시되는 염색체 특이적 DNA 프로브입니다. 이러한 반복은 주로 염색체의 중심체 또는 중심체 이질염색질 영역에 위치합니다. 도움을 받으면 각 염색체를 다른 색상으로 칠할 수 있으므로 염색체의 개별 부분에 보완적이지만 일반적으로 전체 길이를 덮는 정상 수와의 편차와 염색체 수를 신속하게 결정할 수 있습니다. 그러한 프로브의 라이브러리를 사용하여 전체 염색체를 "착색"하고 개인의 차등 스펙트럼 핵형을 얻을 수 있습니다. 이러한 유형의 분석은 한 염색체의 일부가 다른 염색체의 어깨로 옮겨질 때 전위와 같은 염색체 이상을 분석하는 데 사용됩니다.

응용 FISH는 다음과 같은 임상 진단 작업을 해결하는 데 널리 사용됩니다. 1. 태아 이식 및 염색체 이상 진단. 체외 수정(IVF) 클리닉 및 주산기 센터에서 사용됩니다. 적시에(IVF의 경우 또는 태아 발달의 초기 단계에서 배아를 이식하기 전) 태아의 유전적 장애를 식별하고 필요한 조치를 취할 수 있습니다. 2. 종양학. 종양학적 질환은 다양한 염색체 이상으로 인해 발생하므로 적절한 CEP 및 LSI 프로브를 사용하여 진단합니다. 3. 고형 종양의 진단. 현재, 특정 암의 발달과 게놈의 특정 변화 사이에 점점 더 많은 인과 관계가 확립되고 있습니다. 따라서 적절한 DNA 프로브를 사용하면 종양학적 FISH 진단을 수행할 수 있습니다.

간기 세포 유전학: FISH와 다른 방법의 조합: - FISH 면역표현형(FICTION); + FICTION(신생물 조사를 위한 도구로서의 형광 면역표현형 및 인터페이즈 세포유전학) - 종양 세포 연구용. 이 분석을 위해 얼룩이 없는 혈액, 골수 또는 다른 조직의 도말이 사용됩니다. 1단계 - 준비는 특정 단일클론 항체와 함께 배양되고, 2단계 - 형광단과의 접합은 항원-단클론 항체 복합체의 후속 시각화를 위해 수행됩니다. 3단계 - DNA 프로브로 제자리 교잡을 수행합니다. 색상이 다른 형광단은 단클론 항체 및 DNA 프로브를 감지하는 데 사용됩니다. 필요한 필터 세트를 사용하여 형광 현미경으로 제제를 연구하면 간기 핵에서 혼성화 및 신호의 면역 표현형을 동시에 분석할 수 있습니다.

c.에서 TNFAIP 3의 염색체 결실 간기 세포 유전학에 의해 검출된 HL. FICTION의 분석. 대표자 다. HL 케이스 결합. CD 30 발현(빨간색) 및 TNFAIP 3 및 염색체 6 중심체에 대한 FISH 프로브(파란색 [b]). A–C 및 E 및 F의 이중 색상 분석에서 TNFAIP 3 프로브는 녹색(g)으로 표시됩니다. D에 적용된 삼색 분석에서 TNFAIP 3 프로브는 g/orange colocalized (co) 신호를 제공합니다. CD 30 면역형광과 함께 이중 및 삼중 색상 FISH 분석을 표시하기 위해 두 가지 다른 전략이 사용됩니다. 나. 이자형. , 이중 색상 분석(A–C 및 E 및 F)은 삼색 디스플레이를 사용하여 표시되는 반면 Isis 소프트웨어에서 얻은 잘못된 다중 색상 표시는 삼중 색상 분석(D)에 적용되어 4가지 색상을 동시에 표시합니다( 즉, CD 30 [r], TNFAIP 3 [g] 및 주황색, 염색체 6 중심체 [b]).

마이크로 이미지의 디지털 기록은 형광단의 조합뿐만 아니라 그 비율, 강도도 유사색으로 변환할 수 있는 가능성을 열었습니다.

염색체의 다색 염색(Muli. Color Banding - MSV) 이 방법은 모든 염색체의 완전한 분석을 위한 것이 아니라 단일 염색체의 상세한 분석을 위한 것입니다. 유전자좌 특이적 DNA 프로브는 다른 형광단 또는 형광단의 조합으로 표지되어 각 DNA 프로브의 신호 수준이 강도가 다양합니다. DNA 프로브 신호의 겹치는 강도 프로필은 염색체를 따라 다른 형광단의 형광 강도 비율의 변화를 제공합니다. 강도 비율은 의사 색상으로 변환될 수 있으므로 이미지의 각 지점과 결과적으로 각 염색체 좌위는 고유한 의사 색상을 갖게 됩니다. 이 버전의 다색 FISH 방법은 종양 질환에서 염색체간뿐만 아니라 염색체 내 재배열 분석에 매우 효과적인 것으로 밝혀졌습니다. 그러나 성공적인 적용을 위해서는 먼저 조사할 염색체를 결정하는 것이 필요합니다. 이 분자 세포 유전학 방법은 특정 염색체와 관련된 핵형 장애의 분석에 적합합니다.

현재까지 5번 염색체의 모든 인간 염색체에 대한 MCV, 5번 염색체의 다색 밴딩, 5번 염색체의 이디오그램, MSV에 사용되는 형광색소를 제공하는 DNA 프로브 세트가 만들어졌습니다.

역사적으로 간기 세포유전학보다 일찍 발생한 중기 세포유전학은 광범위한 염색체 장애를 결정할 수 있게 해주지만, 이를 위해서는 연구 중인 세포가 감수분열의 중기 단계에 있어야 합니다.

다색 핵형 분석은 팔 또는 전체 염색체에 연속 염색의 DNA 프로브(WCP 프로브 - 전체 염색체 페인트)를 사용하여 수행됩니다. 이러한 프로브는 염색체의 전체 길이를 따라 위치한 수많은 짧은 DNA 서열과 혼성화합니다. 따라서 형광현미경으로 보면 염색체가 일정한 색으로 균일하게 염색된 것처럼 보인다.

이 분석에 사용된 DNA 프로브는 인간 염색체의 전체 세트에 대한 고체 염색 프로브의 혼합물로 구성되며, 그 비율은 각 염색체 쌍에 대해 개별적으로 선택되는 여러 형광색의 조합으로 표시됩니다. 이미지의 각 지점에 대한 모든 형광색의 발광 강도를 평가하는 이미지 분석을 위한 적절한 등록 방법과 컴퓨터 프로그램을 사용하면 각 염색체 쌍이 고유한 "유사색"을 갖는 핵형 분석을 수행할 수 있습니다. ".

M-FISH(multitarget multifluor multicolor or multiplex. FISH)는 형광색소 전용 필터 세트를 사용하는 기존의 다색 FISH의 총칭입니다. M-FISH 원리는 필터 세트를 순차적으로 변경하여 달성되는 사용된 모든 형광색 신호의 개별 디지털 기록으로 구성됩니다. 모든 이미지는 별도의 파일에 기록되므로 신호 및 배경 분리 및 신호 정량화와 관련된 효율적인 처리를 수행할 수 있습니다. 특수 소프트웨어를 사용하여 기록된 모든 정보를 처리하면 이미지의 각 지점에서 형광색 신호 수준에 대한 정보가 의사 색상으로 변환됩니다. 사용되는 DNA 프로브 수의 주요 제한 사항 중 하나는 여기 및 방출 스펙트럼이 겹치지 않는 사용 가능한 형광색소의 수와 적절한 필터 세트의 가용성입니다.

24색 FISH 가장 널리 사용되는 M-FISH는 모든 인간 염색체의 물질을 동시에 식별하기 위한 24색 FISH입니다. 염색체 전위를 감지하는 데 매우 효율적이지만 결실 및 역전을 감지하도록 설계되지 않았습니다. 그러나 이 문제는 DAPI로 염색체를 동시에 염색함으로써 부분적으로 해결할 수 있으며, 이는 이미 염색체 물질이 확인된 염색체의 차별적 줄무늬 분석을 가능하게 한다. 불행히도, M-FISH 후 염색체 DAPI 밴딩의 품질은 GTG 차별 염색 및 기존의 제자리 혼성화 후 DAPI 밴딩보다 상당히 열등하다는 점에 유의해야 합니다.

수신 FISH M-FISH 원리는 인간 염색체에 대한 다색 바코드를 생성하는 데 사용되었으며 종간 교잡을 기반으로 하는 다색 염색체 밴딩 방법입니다. 24색 FISH와 달리 이 방법을 사용하면 염색체 내 재배열의 일부를 직접 감지할 수 있습니다. Rx에 사용된 DNA 프로브. 7가지 유사 색상을 제공하는 3가지 형광색의 조합으로 라벨이 붙은 FISH. 그들은 특히 염색체의 개별 영역을 염색하여 색 줄무늬를 만듭니다. Rx용 DNA 샘플의 이 기능. 물고기는 획득 방법에 따라 결정됩니다. 그들은 Hylobates concolor와 Hylobates syndactylus의 두 긴팔원숭이 종의 염색체 특이적 DNA 라이브러리입니다.

현대 긴팔 원숭이 종의 형성 중에 일어난 강렬한 염색체 재배열의 결과로 염색체의 물질은 염색체가 보수주의로 알려진 인간의 염색체 구성과 비교할 때 크게 뒤섞인 것으로 판명되었습니다. 긴팔원숭이 염색체에 대한 인간 염색체 1의 비율은 그림 1에 나와 있습니다.

그림 2는 Rx의 결과로 얻은 인간 염색체의 일반적인 보기를 보여줍니다. 생선. a) 중기 판 b) 염색체의 배열.

그러나 RXFISH에는 심각한 한계가 있습니다. 한 색상 RX 대역 내에서 발생한 염색체 재배열은 이 대역의 크기에 중요하고 쉽게 눈에 띄는 변화가 발생하지 않는 한 이 방법을 사용하여 감지할 수 없습니다. - 프로브는 하나의 유사색으로 서로 다른 염색체의 여러 염색체 영역을 염색합니다. 그러나 사용되는 형광색소의 수가 증가함에 따라 RXFISH 방법은 의심할 여지 없이 일상적인 24색 FISH보다 더 많은 정보를 제공할 것입니다.

현재 RXFISH의 장점은 다음과 같습니다. 이 방법을 사용하면 단일 다색 FISH 실험으로 전체 인간 게놈을 분석할 수 있습니다. 상업적으로 이용 가능한 표지된 DNA 프로브 세트와 필요한 검출 시스템을 사용할 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 내부 및 염색체 간 재배열의 상당 부분을 신속하게 식별할 수 있습니다. "색상 밴딩"의 중기 염색체 자동 식별이 가능합니다. 각 인간 염색체에는 고유한 색상 바코드가 있습니다. RXFISH는 Cyto 워크스테이션에 통합되어 있습니다. 비전 및 표준 형광 현미경 시스템.

Spectral karyotyping (SKY-spectralkaryotyping) 스펙트럼 핵형에서 현미경 이미지 분석의 기본 원리는 M-FISH에서 사용되는 것과 실질적으로 동일합니다. 차이점은 이미지가 등록되는 방식과 관련이 있습니다. SKY 기술을 사용하면 에피형광 또는 기존 광학 현미경과 관계없이 한 번의 측정 동안 이미지의 모든 지점에 대한 스펙트럼 곡선을 얻을 수 있습니다. 모든 인간 염색체의 스펙트럼 핵형 분석을 위해 5개의 형광색소가 사용되며, 하나는 녹색 스펙트럼, 2개는 빨간색, 2개는 적외선 스펙트럼에 사용됩니다. 라벨링 DNA 프로브에 사용되는 모든 형광색소의 여기 및 방출은 한 세트의 필터로 이루어지므로 순차적 변경, 중간 초점 및 결과적으로 이미지 공간 이동, 임계값 결정과 같은 관련 문제를 피할 수 있습니다. 및 세분화 마스크 . 스펙트럼 곡선의 분석을 기반으로 주어진 지점에서 특정 형광색소의 존재 또는 부재가 결정됩니다.

다음 단계는 분석된 물질의 염색체 관련성을 직접적이고 명확하게 결정할 수 있는 분류 절차입니다. 이것은 마커 염색체 물질의 신뢰성 있는 식별(염색체까지)뿐만 아니라 다양한 재배열로 인한 염색체 유도체를 보장합니다. SKY의 가장 큰 장점은 DAPI 색상이 분광 이미지와 평행하게 등록된다는 것입니다. DAPI 밴딩의 소프트웨어 개선으로 GTG 밴딩에 가까운 품질의 차등 줄무늬를 얻을 수 있습니다. 스펙트럼 이미지의 병렬 분석 및 염색체의 정성적 차별 염색 가능성은 SKY 결과의 해석을 크게 단순화하고 염색체 파손 지점을 보다 정확하게 결정할 수 있게 합니다. SKY의 확실한 장점은 여기 및 방출 스펙트럼이 겹치는 형광색을 사용할 수 있다는 점입니다. 이는 사용 가능한 형광색의 목록을 크게 확장하고 동시에 사용할 수 있는 형광색의 수를 증가시킵니다. 스펙트럼 FISH용 필터 장치 1개와 DAPI용 필터 장치 1개로 SKY용으로 충분하기 때문에 새로운 형광색소 목록에는 새 필터 세트를 구입할 필요가 없습니다.

SKY의 단점은 다음과 같습니다. - 현미경 이미지 기록에 필요한 긴 노출 시간. - SKY는 상대적으로 작은 DNA 프로브로 연구할 때 M-FISH보다 효율성이 다소 떨어집니다.

색상 변경 핵형 분석(CCK 색상 변경 핵형 분석) 이 방법은 형광색소와 연결된 DNA 프로브와 항체를 운반하는 DNA 프로브와 혼성화된 DNA 샘플 간의 신호 길이 차이 분석을 기반으로 합니다. 이 방법은 3개의 필터만으로 가능하며 특별한 카메라와 소프트웨어가 필요하지 않습니다. 염색체를 확인하기 위해 한 번의 교잡을 수행하고 두 개의 이미지를 얻습니다. 이 방법은 항체와 관련된 DNA 샘플의 노출 시간이 형광색소와 관련된 샘플의 노출 시간보다 80~90% 적기 때문에 형광 신호 길이의 차이를 기반으로 합니다. 혼성화 반응 후 면봉을 적절한 1차 항체에 노출시킨 다음 시각화하여 첫 번째 이미지를 얻습니다. 그런 다음 슬라이드는 동일한 형광색소에 결합된 이차 항체 및 아비딘에 노출됩니다. 스트로크는 DAPI를 사용하여 대조염색될 수 있습니다.

앞으로 3개의 필터를 차례로 사용하여 준비 이미지를 다시 얻습니다. 이 이미지는 특수 소프트웨어를 사용하여 비교되고 특정 항체와 관련된 염색체만 보이는 두 번째 이미지를 얻습니다. 따라서 일부 염색체는 첫 번째 또는 두 번째 스캔에서만 형광을 내고 다른 염색체는 다른 스캔에서 색상이 변경됩니다.

비교 게놈 하이브리드화(CGH) 이 방법은 게놈의 정량적 장애를 식별하기 위해 만들어졌습니다. 전체 게놈을 DNA 프로브로 사용하여 in situ hybridization 반응을 수행하는 것을 기반으로 합니다. 분리되고 정상인 기증자 DNA는 다른 색상의 형광색소로 표지되어 DNA 프로브로 바뀝니다. 동량의 이러한 프로브가 혼합되어 대조군 세포유전학적 제제와의 혼성화에 사용됩니다. FISH 후, 중기는 각 염색체의 전체 길이를 따라 두 형광색소의 형광 강도를 결정하기 위해 특수 컴퓨터 이미지 분석 프로그램을 사용하여 형광 현미경으로 분석됩니다.

시험 샘플의 핵형에 정량적 변화가 없는 경우, 두 형광색소의 발광 강도의 특정 비율이 관찰됩니다. 유전자 증폭의 경우 해당 형광색소의 신호 강도가 증가하고 유전 물질의 일부가 소실된 경우 반대로 약해집니다. 따라서 CGH는 게놈 불균형을 감지할 수 있지만 이 방법은 균형 전위 및 역전을 감지하는 데 사용할 수 없으며 불균형 영역의 크기가 천만 염기쌍 이상인 경우에만 삼염색체 및 결실을 감지할 수 있습니다.

형광비(RF)를 계산하여 두 가지 다른 형광색소의 형광 강도 차이에서 테스트 샘플의 염색체 불균형을 추정합니다.

CGH 방법은 게놈 변화를 분석하는 다른 방법에 비해 여러 가지 장점이 있습니다. 첫째, 시험 물질의 출처에 의존하지 않으며, 보관 물질을 포함하여 시험된 소량의 DNA로 성공적으로 수행할 수 있습니다. 둘째, 단일 실험으로 게놈 전체의 유전 물질 사본 수의 손실 또는 증가에 대한 자세한 정보를 얻을 수 있습니다. 셋째, CGH 방법은 연구 중인 조직에서 중기 염색체 준비의 준비가 필요하지 않습니다. 즉, 세포 배양 과정 및 관련 인공물에 의존하지 않습니다.

게놈 situ hybridization(genomicin situ hybridization in, GISH)은 situ hybridization 방법의 변형으로, 고정된 샘플과의 혼성화를 위해 유기체 한 종의 전체 게놈 DNA를 형광 표지 프로브로 사용한다는 사실로 구성됩니다. 유기체의 다른 종의 전체 게놈 DNA가 경쟁하는 것; 게놈, 염색체 재배열, 결실 및 치환의 종간 및 종내 차이를 결정하는 데 사용됩니다.

FISH 변형 1) Q-FISH – 정량적 FISH: Lansdorp et al: U. M. Martens, J. M. Zijlmans, S. S. Poon, W. Dragowska, J. Yui, E. A. Chavez, R. K. Ward 및 P. M. Lansdorp에 의해 개발되었습니다. 1998. 인간 염색체 17 p의 짧은 텔로미어. Nat. 그 가죽. 18:76-80. 정량적 방법. 유세포 분석과 함께 작동하도록 설계되었습니다. 원래 텔로미어 반복 수를 계산하여 염색체 길이(분해능: 200bp)를 측정하는 데 사용되었습니다. PNA 결합 프로브가 사용됩니다. 초기에는 중기 염색체가 연구되었으며(QFISH 적합), 이제는 이 방법을 간기 염색체(IQ-FISH)에도 적용할 수 있습니다. Q-FISH는 세포 배양, 조직 절편(둘 다 안경)에서 수행됩니다. 현재 Q-FISH는 노화 및 암 형성 과정에서 텔로미어의 역할 연구에서 중요한 도구입니다.

PNA-FISH - 펩타이드 핵산 FISH: 펩타이드 핵산(PNA)은 질소 염기를 지지하는 데옥시리보스 포스페이트의 당 백본이 전하를 띠지 않는 펩타이드 백본으로 대체된 DNA의 합성 유사체입니다. 이 구조의 결과: PNA-올리고머 프로브가 상보적 DNA/RNA와 혼성화할 때 정전기적 반발이 발생하지 않습니다. PNA-DNA(PNA-RNA) 이중가닥은 천연 호모/이중 이중가닥보다 훨씬 안정적입니다. PNA-DNA 결합의 높은 특이성: PNA-DNA 혼성화는 DNA-DNA 혼성화보다 염기쌍 불일치에 훨씬 더 민감합니다. 따라서 PNA 프로브를 사용하면 하나의 염기 쌍에서만 다른 두 개의 중심체 반복을 구별할 수 있습니다. PNA는 (DNA와 비교하여) 상대적인 소수성을 가지며, 그 결과 PNA가 세포벽을 통해 더 잘 확산 => 미생물학에서 폭넓게 적용됩니다. 높은 결합 특이성 기반: PNA 기술은 곧 제자리 교잡을 위한 대립유전자 특이적 프로브 생성의 기초가 될 것으로 믿어집니다. 유전학, 세포 유전학, 후성 유전학, 미생물학 등에 사용됩니다.

3) 유세포 분석을 위한 Flow-FISH - FISH: Rufer, N., Dragowska, W., Thornbury, G., Roosnek, E. & Lansdorp, P. M. 유세포 분석에 의해 측정된 인간 림프구 하위 집단의 Telomere 길이 역학에 의해 1998년에 제안되었습니다. . 자연생명공학. 16, 743–747(1998). 신호 분석(측정) 및 분류를 허용하는 Q-FISH와 유세포 분석의 조합. flow-FISH의 경우 세포 현탁액(염색체 텔로미어의 길이 측정용), 염색체 퍼짐 및 분리된 염색체(추가 매핑용)가 사용됩니다. Q-FISH에서와 같이 PNA 태그가 붙은 텔로머 프로브가 사용됩니다(예: 이미징 및 텔로머 반복 길이 측정용) 주요 이점은 더 빠른 방법(많은 수의 세포/염색체 분석/분류)입니다. 노화, 텔로미어 보존, 생체 외 조혈 줄기 세포 현탁액 연구, 박테리아 연구와 같은 다양한 문제를 연구하는 데 널리 사용됩니다.

다중 매개변수 분석을 통해 하나의 샘플 내에서 세포 유형을 분화할 수 있으므로 내부 제어 및 백혈구 하위 유형 분석이 가능합니다.

flow-FISH의 이점: 쉽게 재현할 수 있는 결과 물리적 면역형광 및 마커를 사용하여 모집단에서 세포의 하위 그룹을 분석하는 기능 Q-FISH보다 우수한 성능 수천 개의 세포의 형광을 정량화하는 기능.

유세포 분석에 의한 분리된 염색체의 조사 1. 유세포 분석에 의한 염색체 분류 - 유세포 분석에 의한 핵형 분석은 유전자를 추가로 매핑하고 염색체 라이브러리를 구축하는 데 사용됩니다. - 분류된 염색체 상의 유전자의 동정 및 위치결정은 후속적으로 FISH 방법/PRINS 방법(primed in situ labeling) 또는 그 변이 및 염색체 특이적 PCR을 사용하여 수행됩니다. - 2011년까지 현재까지 재배식물 17종의 염색체 분류에 성공함. - 분열 지수가 높은 중기 또는 후연염색체의 분류.

형광 표지: - 염색체는 핵산 특이적 형광색소로 표지됩니다. - 형광색소는 1) 질소 염기에 대한 특이성, 2) 실험 조건(사용 가능한 레이저의 파장 고려 포함)에 따라 선택됩니다. 1. 일변량 분석의 경우 A-T 또는 G-C 쌍에 특이적이지 않은 염료를 사용하십시오. 여기 피크: : 300 및 520 nm, 방출: 600 nm, 필요한 레이저: 488 nm 아르곤 레이저 또는 램프 + 롱 패스 필터) 이 라벨은 A, G, T 또는 질소 염기의 함량에 관계없이 DNA를 염색합니다. 2. 이변량 분석을 위해 사용: 크로모마이신(G-C 염기쌍에 대해 특이적임), 피크 A 3 여기: 458 nm, 방출 580 nm. 레이저: , 458nm 최소 400m V 전력. Hoechst 33258(A-T bp에만 해당), 여기: 351-364 nm, 방출: 470 nm. 레이저: 351 -364 nm(강력). 형광색 스펙트럼의 부분적 겹침으로 인해 레이저는 시간과 공간에서 분리되어야 합니다.

2. 분류 후 염색체/뉴클레오티드 서열 연구(물리적 및 유전적 지도 작성 등) FISH BAC-FISH PRINS C-PRINS 긴 염색체를 가진 큰 게놈 연구. 많은 수의 반복이 있는 시퀀스 매핑(예: 텔로머 및 중심체 영역). 짧은 프로브 사용. 반복 횟수가 많기 때문에 신호가 강합니다. 표준 프로브 크기: 15 - 30개 뉴클레오티드. 생선

FISH 문제: 표준 짧은 프로브를 사용할 때 신호가 매우 약하기 때문에 단일 유전자좌 DNA 서열(즉, 비반복 고유 DNA 서열)의 위치를 ​​파악하는 것은 어렵습니다. 신호를 향상시키기 위해 프로브의 길이를 몇 킬로베이스로 늘리면 감도가 감소하고 => 비특이적 결합이 됩니다. 솔루션: BAC-FISH -BAC-FISH는 FISH 방법과 세균 인공 염색체(BAC)에 통합된 게놈 DNA 클론 사용의 조합으로, 큰 DNA 서열을 삽입할 수 있습니다. - 작은 게놈을 가진 유기체의 개별 염색체를 식별하고 매핑하는 효율적인 방법입니다. BAC 프로브, 오버고스(중첩 올리고뉴클레오티드)가 프로브로 사용됩니다.

FISH의 대안: PRINS PRINS(primed in situ labeling)는 변성된 염색체 DNA의 상동 서열이 있는 올리고뉴클레오티드 DNA 프라이머를 어닐링한 후 표지된 뉴클레오티드를 사용하여 프라이머를 제자리에서 효소적 확장하여 염색체를 표지하는 방법입니다. Koch et al. 1989년 (Koch, J. E., Kølvraa, S., Petersen, K. B., Gregersen, N. 및 Bolund, I. (1989) Oligonucleotide-priming methods for 염색체-specific labeling of alpha 위성 DNA in situ. Chromosoma 98, 259 -265). PRINS는 FISH의 대안입니다. 뉴클레오티드 서열의 위치 파악, 중기 또는 간기 염색체 또는 염색체 쌍(염색체 이수성 포함)의 인식 및 계수에 사용됩니다. 관심 DNA로 표지되지 않은 프라이머(프라이머-프라이머)의 어닐링 열안정성 DNA 중합효소 및 표지된 뉴클레오티드의 도움으로 프라이머의 연장 반응 종료(3'-말단에 차단 분자 부착) 프라이머 : PCR 제한 단편 - 간접(biotin/dig fluorochrome-conjugated avidin/anti-dig) - 각 PRINS 반응의 결과에서 한 쌍의 상동염색체(한 염색체)만 식별할 수 있습니다. 동일한 슬라이드에서 다음 PRINS 반응은 이전 슬라이드를 차단한 후에만 수행할 수 있습니다. - 반복수가 많은 DNA 염기서열에 사용.

PRINS의 장점: 1. 올리고뉴클레오티드 프라이머 합성에 필요한 최소한의 서열 정보가 필요합니다. 2. 염색체에서 관심 서열을 검출하는 가장 빠르고 간단한 방법(매우 오랜 기간에 걸쳐 혼성화하는 무거운 FISH 프로브를 사용하는 것과 비교). 3. 프로브 라벨링 단계의 제외. 4. 짧은 고유 서열을 검출할 때 c-PRINS 신호를 강화하기 위해 표지된 뉴클레오티드로 프라이머를 연장하는 능력. 낮은 복제 반복 또는 짧은 고유 시퀀스를 식별하기 위해 보다 민감한 방법인 사이클링 PRINS(c-PRINS)가 사용됩니다. C-PRINS는 Gosden et al.에 의해 제안되었습니다. 1991년 Kubaláková et al.에 의해 널리 사용되는 개선된 프로토콜입니다. , 2001 (Kubaláková M, Vrána J, Cíhalíková J, Lysák MA, Dole J (2001). PRINS 및 C-PRINS를 사용한 식물 염색체 상의 DNA 서열의 국소화. Methods in Cell Science 23: 71-82). C-PRINS는 PCR과 유사한 일련의 열 사이클을 포함합니다.

FISH용 외피액: -BD Bioscience Standard(GM Baerlocher, I Vulto, G de Jong, PM Lansdorp. 텔로미어의 평균 길이를 측정하기 위한 유세포 분석 및 FISH(유동 FISH). 2006. Nature Protocols 1, - 2365 – 2376) -40미터 M KCl + 10m. 엠 나. Cl (Vrána J, Kubaláková M, Simková H, Cíhalíková J, Lysák MA, Dolezel J. Flow sorting of mitotic chromatography in common wheat (Triticum aestivum L.) Genetics. 2000; 156(4): 2033-41) -Mg . So 4 buffer without dithiothreitol (Lj. Li, L. Ma, K. Arumuganathan, Y.C. Song. Flow-sortedchromes: a fine material for plant gene physical mapping. Caryologia. 2006, vol. 59, no. 2: 99-103 ) -오토클레이브된 0.1%(wt/vol) Na. Cl-50m. 엠 나. Cl (M Kubaláková, P Kovářová, P Suchánková, J Číhalíková, J Bartoš, S Lucretti, N Watanabe, SF Kianian, J Doležel. 염색체 분류 in Tetraploid Wheat and Its Potential for Genome Analysis. Genetics. 2005(2): 170 823–829) -염색체 안정화 폴리아민 완충액(단백질 함유 외피액)(Darzynkiewics Z, Robinson JP, Crissman H. Flow Cytometry, 2nd Ed. Part B. San Diego, CA. Academic Press, Inc. 1994)

표준 현미경으로는 분자 수준에서 세포를 검사할 수 없습니다. 강력한 증가만으로는 충분하지 않습니다. 디지털 이미징, 추가 시약 및 기타 재료 및 도구가 필요합니다. DNA와 RNA의 분석은 현재 In situ hybridization이라 불리는 방법이 사용된다. 이것은 샘플을 염색한 후 방사선 분석을 포함하기 때문에 형광 혼성화 또는 FISH라고도 합니다.

형광성 제자리 교잡은 유전 연구, 암 진단, 임신 관리 및 기타 많은 과학 분야에서 널리 사용됩니다. 이 방법은 이름에서 알 수 있듯이 DNA와 RNA 분자가 프로브와 안정적인 결합, 즉 하이브리드 분자를 형성하는 특성을 기반으로 합니다. "현장(In situ)"이라는 단어는 모든 관찰이 "현장(in situ)", 즉 추가 매체를 사용하지 않고 직접 이루어짐을 의미합니다.

DNA 프로브(프로브)는 테스트 샘플의 분자에 상보적입니다. 여기에는 형광단(분자에 형광 특성을 부여하는 물질)으로 표지된 뉴클레오사이드가 포함됩니다. 이 방법을 직접 라벨링이라고 합니다. 하이브리드 접합체 분자가 마커로 사용되는 경우 간접 표지가 얻어집니다. 직접 라벨링을 사용하면 하이브리드화가 완료된 직후 형광 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 간접 라벨링의 경우 다른 염색 절차가 수행됩니다. 색으로 연구된 샘플에서 접합체 분자를 분리합니다.

간접 라벨링을 사용한 혼성화 방법은 더 많은 시간과 시약이 필요하지만 보다 신뢰할 수 있는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 경우 신호 레벨은 더 높을 것이며 또한 단계적 증폭도 가능합니다. 복제된 DNA 서열(PCR 제품, 게놈 DNA, 표지된 올리고뉴클레오티드 등)은 표지 프로브로 사용됩니다. 프로브 라벨링은 여러 가지 방법으로 수행됩니다. 일반적인 방법은 nick translation 및 표지된 뉴클레오티드를 사용한 중합효소연쇄반응(PCR)입니다.

절차의 순서

In situ 방법은 준비 단계인 프로브 설계로 시작됩니다. 프로브의 치수는 연구 과정을 방해할 만큼 크지 않아야 합니다. 너무 작은 프로브도 신뢰할 수 있는 결과를 보장하지 않으므로 바람직하지 않습니다. 따라서 최대 1,000bp 크기의 프로브가 연구에 사용됩니다. 프로브가 이중 가닥 DNA인 경우, 혼성화 전에 산이 변성됩니다. 원하는 결과가 얻어지면(염색체의 특정 영역 또는 모든 염색체가 염색됨) 반복 서열을 가진 DNA 프로브의 추가 혼성화가 차단됩니다. 이를 위해 표지되지 않은 DNA 반복 분자가 혼성화 혼합물에 추가됩니다.

연구의 다음 단계는 간기 핵 또는 중기 염색체의 준비입니다. 세포는 유리의 기판에 고정된 후 DNA가 변성됩니다. 변성 온도를 낮추고 핵과 염색체의 형태를 보존하기 위해 포마다이드를 첨가하여 변성을 수행합니다. 그 후, 프로브를 재료에 추가하고 몇 시간 동안 혼성화를 수행합니다. 완료되면 샘플 분자와 연결되지 않은 프로브를 제거하기 위해 다단계 세척이 수행됩니다.

염색체의 질적 및 양적 변화(전좌 및 미세결실 포함)를 결정할 수 있고 악성 혈액 질환 및 고형 종양의 감별 진단에 사용되는 현대적인 세포 유전 분석 방법.

러시아어 동의어

형광 제자리 교잡

물고기 분석

영어 동의어

형광 현장에서이종 교잡

연구 방법

형광 제자리 교잡.

연구에 사용할 수 있는 생체 재료는 무엇입니까?

조직 샘플, 파라핀 블록의 조직 샘플.

연구를 올바르게 준비하는 방법은 무엇입니까?

준비가 필요하지 않습니다.

연구에 대한 일반 정보

FISH(Fluorescent in situ hybridization) 안에- 현장교잡)은 염색체 이상을 진단하는 가장 현대적인 방법 중 하나입니다. 형광 표지로 표지된 DNA 프로브의 사용을 기반으로 합니다. DNA 프로브는 특별히 합성된 DNA 단편으로, 그 서열은 연구된 비정상적인 염색체의 DNA 서열과 상보적입니다. 따라서 DNA 샘플은 구성이 다릅니다. 다른 특정 DNA 샘플을 사용하여 다양한 염색체 이상을 확인합니다. DNA 프로브는 크기도 다양합니다. 일부는 전체 염색체로, 다른 일부는 특정 유전자좌로 지정될 수 있습니다.

혼성화 과정에서 검사 시료에 비정상적인 염색체가 있으면 DNA 프로브에 결합하여 형광현미경으로 검사하면 형광 신호(FISH 검사 양성)로 판별됩니다. 비정상 염색체가 없는 경우 결합되지 않은 DNA 샘플은 반응 중에 "씻겨나갑니다". 형광 현미경을 사용하여 검사할 때 형광 신호가 없는 것으로 정의됩니다(음성 FISH 테스트 결과). 이 방법을 사용하면 형광 신호의 존재뿐만 아니라 그 강도와 위치도 평가할 수 있습니다. 따라서 FISH 검사는 정성적 방법일 뿐만 아니라 정량적 방법이기도 합니다.

FISH 검사는 다른 세포유전학적 방법에 비해 많은 장점이 있습니다. 우선, FISH 연구는 중기 및 간기 핵, 즉 비분열 세포 모두에 적용할 수 있습니다. 이것은 중기 핵에만 적용되는 고전적 핵형 분석법(예: 염색체의 Romanowsky-Giemsa 염색)에 비해 FISH의 주요 이점입니다. 따라서 FISH는 고형 종양을 포함하여 증식 활성이 낮은 조직에서 염색체 이상을 감지하는 더 정확한 방법입니다.

FISH 검사는 간기 핵의 안정한 DNA를 사용하기 때문에 미세 각도 흡인 생검 흡인물, 도말, 골수 흡인물, 생검 표본, 그리고 중요하게는 조직학적 블록과 같은 보존된 조직 조각과 같은 다양한 생체 재료를 연구에 사용할 수 있습니다. . 따라서 예를 들어 FISH 검사는 "유방 선암종"의 진단 및 종양의 HER2/neu 상태를 결정할 필요성을 확인할 때 유방 생검 표본의 조직학적 블록에서 얻은 반복 준비에 대해 성공적으로 수행할 수 있습니다. 현재로서는 FISH 연구가 종양 표지자 HER2/neu(IHC 2+)에 대한 종양의 면역조직화학적 연구의 불확실한 결과를 수신하는 경우 확증적 테스트로 권장된다는 점을 강조해야 합니다.

FISH의 또 다른 장점은 기존 핵형 분석이나 PCR로는 감지되지 않는 미세결실을 감지할 수 있다는 것입니다. 이것은 DiGeorge 증후군과 velocardiofacial 증후군이 의심되는 경우에 특히 중요합니다.

FISH 검사는 주로 종양학에서 악성 질환의 감별 진단에 널리 사용됩니다. 임상 사진 및 면역조직화학적 데이터와 결합된 염색체 이상은 림프 및 골수증식성 질환의 분류, 치료 전술 및 예후 결정의 기초입니다. 고전적인 예로는 만성 골수성 백혈병 - t(9, 22), 급성 전골수구성 백혈병 - t(15, 17), 만성 림프구성 백혈병 - 12번 삼염색체증 등이 있습니다. 고형 종양의 경우 FISH 연구는 유방암, 방광암, 결장암, 신경모세포종, 망막모세포종 등의 암 진단에 가장 많이 사용됩니다.

FISH 연구는 태아 및 착상 전 진단에도 사용할 수 있습니다.

FISH 검사는 종종 분자 및 세포 유전학적 진단의 다른 방법과 함께 수행됩니다. 이 연구의 결과는 추가 실험실 및 도구 데이터의 결과와 함께 평가됩니다.

연구는 무엇에 사용됩니까?

• 악성 질환(혈액 및 고형 장기)의 감별 진단용.

연구 일정은 언제입니까?

• 악성 혈액 질환이나 고형 종양의 존재가 의심되는 경우 치료 전술과 예후는 종양 클론의 염색체 구성에 따라 다릅니다.

결과는 무엇을 의미합니까?

긍정적인 결과:

• 테스트 샘플에서 비정상적인 염색체의 존재.

부정적인 결과:

• 테스트 샘플에 비정상적인 염색체가 없습니다.

결과에 영향을 줄 수 있는 것은 무엇입니까?

• 비정상적인 염색체의 수.



• 임상물질의 면역조직화학 연구(1항체 사용)
• 임상 물질의 면역조직화학 연구(4개 이상의 항체 사용)
• FISH에 의한 HER2 종양 상태의 결정
• CISH 방법에 의한 HER2 종양 상태의 결정

누가 연구를 지시합니까?

종양 전문의, 소아과 의사, 산부인과 의사, 유전학자.

문학

• 완 TS, 마 ES. 분자 세포 유전학: 암 진단을 위한 필수 도구. 항암제 2005년 7월-8월;25(4):2979-83.
• Kolialexi A, Tsangaris GT, Kitsiou S, Kanavakis E, Mavrou A. 혈액암에 대한 세포 유전학 및 분자 세포 유전학 연구의 영향. Chang Gung Med J. 2012 Mar-Apr;35(2):96-110.
• Mühlmann M. 암 및 유전 연구, 진단 및 예후를 위한 중기 및 간기 세포의 분자 세포 유전학. 조직 절편 및 세포 현탁액에 적용 Genet Mol Res. 2002년 6월 30일;1(2):117-27.