Практична робота з мікробіології. Практикум з мікробіології

Федеральне агентство з освіти

Державна освітня установа

«Іркутський державний університет»

МАЛИЙ ПРАКТИКУМ ПО МІКРОБІОЛОГІЇ

Навчально-методичний посібник

Іркутськ 2009

УДК 579 (076.5)

Друкується за рішенням редакційно-видавничої ради Іркутського державного університету

Жилкіна практикум з мікробіології: Навчальний метод. посібник для студ. вищ. навч. закладів за спеціальностями «Мікробіологія», «Біологія» та «Фізіологія».

6. Мікробна маса не повинна забруднювати руки, стіл і навколишні предмети. Пролилася мікробну суспензію знешкоджують, використовуючи дезінфікуючі засоби.

7. Після закінчення роботи культури здають викладачеві, засіяні пробірки і чашки ставлять в термостат.

8. Бактеріологічні петлі, голки, пінцети та інші металеві предмети після зіткнення з мікроорганізмами пропалюють в полум'ї спиртівки і ставлять в спеціальний штатив.

9. Використані предметні і покривні скла, піпетки, шпателі і т. Д. Поміщають в 3-5% -ний розчин карболової кислоти або інші дезинфікуючі розчини.

10. Відпрацьовані культури в пробірках, чашках Петрі і т. Д. Знешкоджують за допомогою дезінфікуючих розчинів протягом доби, потім посуд кип'ятять і миють.

11. Слід строго дотримуватися особистої гігієни - після закінчення роботи необхідно ретельно вимити руки з милом.

12. Необхідно дотримуватися техніки безпеки при роботі з електроприладами та хімічними реактивами.

ЗАГАЛЬНА МІКРОБІОЛОГІЯ
Глава I. Мікроскоп і техніка мікроскопіропанія
1. світлооптичних мікроскопія
2. Мікроскопія в темному полі
3. Фазово-контрастна мікроскопія
4. Люмінесцентна (флуоресцентна) мікроскопія
Глава II. Загальні уявлення про культивування, техніці посіву і необхідне устаткування для роботи з мікроорганізмами
Глава III. Методи приготування препаратів мікроорганізмів
Глава IV. Дослідження мікробної клітини
1. Форми клітин мікроорганізмів
2. Будова клітин мікроорганізмів (цитохимические методи дослідження)
3. Забарвлення клітин мікроорганізмів по Граму
4. Забарвлення суперечка у бактерій
5. Забарвлення капсул
6. Забарвлення джгутиків
7. Забарвлення ядерного речовини бактерій
8. Забарвлення включень клітин мікроорганізмів
Глава V. Харчування мікроорганізмів
1. Значення окремих поживних елементів
2. Приготування поживних середовищ
3. Методи стерилізації
Глава VI. Облік чисельності бактерій і виділення чистої культури
1. Облік чисельності бактерій в грунті
2. Визначення якісного складу бактерій
3. Облік чисельності мікроорганізмів у воді і інших рідинах
4. Облік чисельності бактерій в повітрі
5. Виділення чистих культур бактерій
Глава VII. Визначення виду бактерій
Глава VIII. Перетворення мікроорганізмами безазотистих органічних речовин
процеси бродіння
1. Спиртове бродіння
2. Молочнокисле бродіння
3. Маслянокислое бродіння
4. Бродіння пектинових речовин
5. Бродіння целюлози
6. Окислення клітковини
7. Окислення жиру
8. Окислення вуглеводнів
Глава IX. Перетворення мікроорганізмами органічних і мінеральних сполук азоту
1. Амоніфікація
2. Нітрифікація
3. Денітрифікація (нітратне дихання)
4. Біологічна фіксація атмосферного азоту
Глава X. Перетворення мікроорганізмами сполук сірки, заліза і фосфору
1. Перетворення мікроорганізмами сполук сірки
2. Участь мікроорганізмів у перетворенні заліза
3. Перетворення мікроорганізмами сполук фосфору
СІЛЬСЬКОГОСПОДАРСЬКА МІКРОБІОЛОГІЯ
Глава XI. Загальний мікробіологічний аналіз грунту
1. Методи досліджень
2. Групи мікроорганізмів, склад і приготування поживних середовищ
3. Взяття середньої грунтової проби і підготовка зразка до мікробіологічного аналізу
4. Приготування грунтової суспензії
5. Облік різних груп мікроорганізмів
6. Визначення загальної кількості мікроорганізмів в грунті методом прямого рахунку під мікроскопом
Глава XII. Вивчення ценозов мікроорганізмів
1. Метод обростання стекол по Н. Г. Холодного
2. Вивчення мікробних ценозів в грунті за методом Перфільева і Габе
3. Метод капілярів Перфільева в модифікації Арістовской
4. Виявлення мікроорганізмів автохтонної групи, що бере участь в розкладанні гумусових речовин, за методом Виноградського в модифікації Теппер
5. Виявлення мікроорганізмів, що беруть участь в розкладанні гумусових речовин, за методом Теппер
Глава XIII. Визначення біологічної активності грунту
1. Визначення біологічної активності грунту за інтенсивністю розкладання полотна (метод Мишустина, Вострова і Петрової)
2. Визначення загальної мікробіологічної активності грунту по виділенню вуглекислого газу
3. Визначення аммоніфіцірующей активності грунту
4. Визначення аммоніфіцірующей активності мікроорганізмів
5. Визначення нитрифицирующих активності грунту
6. Визначення денитрифицирующих активності грунту
7. Визначення азотфиксирующей активності мікроорганізмів
Глава XIV. Вивчення бактерій кореневої зони рослин і на коренях
1. Облік бактерій в ризосфері методом Красильникова
2. Облік ризосферной і кореневої мікрофлори методом послідовних відмивань коренів по Е. 3. Теппер
3. Виділення чистих культур бульбочкових бактерій, кількісний облік в грунті, визначення їх активності і вірулентності
Глава XV. Аналіз бактеріальних препаратів
Глава XVI. Мікробіологія кормів
1. епіфітний мікрофлора зерна і її зміна при зберіганні корму
2. Аналіз силосу
3. дріжджуванні корми
Глава XVII. Мікрофлора молока та молочних продуктів
1. Бактеріологічний аналіз молока
2. Методи виділення молочнокислих бактерій в чисту культуру
3. Знайомство з мікрофлорою вершкового масла
покажчик літератури

транскрипт

1 Міністерство освіти і науки Російської Федерації Федеральне агентство з освіти Московський державний університет інженерної екології Кустова Н.А. ЛАБОРАТОРНИЙ ПРАКТИКУМ ПО МІКРОБІОЛОГІЇ Москва 2005

2 Лабораторний практикум з мікробіології призначений для студентів спеціальностей 3207 і 3302 з дисципліни «Основи мікробіології і біотехнології», а також для студентів кафедри «Екологічна та промислова біотехнологія» з дисципліни «Екологічна та промислова мікробіологія». Практикум складається з трьох розділів. Перший розділ присвячений питанням загальної мікробіології. У роботах цього розділу вивчаються морфологічну будову різних груп мікроорганізмів, методи мікроскопічного дослідження, техніка мікробіологічних посівів, методи стерилізації та методи кількісного обліку мікроорганізмів. Другий розділ містить роботи по використанню мікробів в біотехнології для отримання різних речовин органічних кислот, спиртів, антибіотиків, ферментів. У роботах третього розділу вивчаються питання екологічної мікробіології. Частина робіт показує роль мікроорганізмів в глобальних біогеохімічних циклах, а решта присвячені проблемам біотехнологічної охорони навколишнього середовища. Кожна тема містить теоретичне введення та практичну частину, в якій даються опис застосовуваних методів, порядок виконання роботи, зміст звіту по роботі, а також контрольні питання. 2

3 ПЕРЕДМОВА Лабораторний практикум з мікробіології призначений для студентів 3 курсу спеціальностей 3207 і 3302 з дисципліни «Основи мікробіології і біотехнології», а також для студентів 4 курсу кафедри «Екологічна та промислова біотехнологія» за спеціалізацією «Біотехнологічна захист навколишнього середовища» з дисципліни «Екологічна та промислова мікробіологія ». В основу Лабораторного практикуму покладено «Методичні вказівки до лабораторних робіт» під ред. П.І.Ніколаева, які використовувалися на кафедрі «Процеси і апарати мікробіологічних виробництв» з моменту створення кафедри. В викладання мікробіології при навчанні інженерів для мікробіологічної промисловості величезний внесок внесла с.н.с., к.б.н. Н.В.Поморцева. Методичні вказівки були підготовлені під її керівництвом науковими співробітниками кафедри: М.А.Боруздіной, І.Е.Ломовой, Н.А.Кустовой, Т.А.Махоткіной і К.А.Соловьевой. зміна навчальної програми відповідно до нової спеціальністю інженер-еколог викликало необхідність розширити курс мікробіології і доповнити його завданнями з біотехнологічних методів захисту навколишнього середовища. Лабораторний практикум складається з трьох розділів. Перший розділ присвячений загальній мікробіології: морфології мікроорганізмів, методам її вивчення, техніці мікробіологічних посівів, методам кількісного обліку мікроорганізмів. Другий розділ охоплює деякі приклади використання мікробів в промисловості. Третій розділ висвітлює питання екології мікроорганізмів, їх роль в глобальних циклах елементів, а також в біотехнологічних способах охорони навколишнього середовища. У складанні даного практикуму взяли участь аспірант кафедри Н.В.Зябрева і с.н.с. Е.С.Горшіна. Автор висловлює глибоку подяку доц. каф. мікробіології МГУ М.М. Колотілова за цінні зауваження та поради, а також с.н.с. П.П.Макееву за допомогу в оформленні тексту та ілюстративного матеріалу. 3

4 4 ЗАГАЛЬНІ ПРАВИЛА РОБОТИ В МІКРОБІОЛОГІЧНОЇ ЛАБОРАТОРИИ Правила роботи і поведінки в лабораторії Правила роботи і поведінки в мікробіологічній лабораторії мають багато спільного з правилами роботи в хімічних лабораторіях, але мають свою специфіку. Мікробіолог в більшості випадків працює з чистими культурами мікроорганізмів, тобто з мікроорганізмами якого-небудь одного роду, виду і штаму. Оскільки на всіх оточуючих предметах і в повітрі знаходяться сторонні мікроби, застосовуються спеціальні методи роботи, щоб уникнути зараження досліджуваної культури мікроорганізму або самої людини. Для цього поживні середовища, посуд, інструменти стерилізують, лабораторію і робочі місця містять в чистоті, дотримуються певних правил при роботі з мікробами. В лабораторії не повинно бути ніяких зайвих предметів. Слід регулярно проводити вологе прибирання. Різні поверхні лабораторних приміщень періодично піддають дезинфекції. Дезінфекція це знезараження, тобто знищення збудників інфекційних хвороб на об'єктах зовнішнього середовища. Для цього використовують 0,5 3% -ний розчин хлораміну або 3 5% -ний розчин фенолу (карболової кислота). Робочий стіл слід дезінфікувати 70% -ним розчином етилового або ізопропілового спирту. Дезінфекція повітря досягається простим провітрюванням (не менше хв). Більш ефективний спосіб дезінфекції повітря опромінення приміщення ультрафіолетовими променями за допомогою бактерицидних ламп. Особливо часто ультрафіолетове опромінення застосовується для стерилізації боксу. Бокс спеціальне невелике приміщення для пересівань чистих культур, кількісного обліку мікроорганізмів на чашках Петрі і деяких інших робіт, що потребують особливо чистих умов. Перед роботою бокс опромінюють протягом хв. Стіл протирають спиртом, стіни і підлогу періодично миють. Замість боксу лабораторії можуть оснащуватися ламінарними шафами (рис. 1), які також стерилізуються бактерицидними лампами. при

5 роботі включають вентилятор для створення ламінарного потоку стерильного повітря, пропущеного через бактерицидні фільтри. Основне обладнання мікробіологічної лабораторії включає в себе: мікроскопи, термостати для вирощування мікроорганізмів, апаратуру для стерилізації (автоклав і сушильну шафу), центрифуги, дистилятор, холодильник для зберігання музейних культур мікроорганізмів, шафи для розміщення скляного посуду і реактивів, необхідні прилади (фотоелектроколориметри, рн лічильник і т.д.). За кожним студентом закріплюють робоче місце, на якому розміщують: мікроскоп, що закривається чохлом, бактеріологічну петлю, предметні і покривні скла, стерильні піпетки, спиртову пальник, смужки фільтрувального паперу, маркер по склу, посудину з дезинфікуючою рідиною. На столі не повинно бути нічого, що не відноситься безпосередньо до виконання роботи. На лабораторних заняттях з мікробіології слід дотримуватися правил техніки безпеки. 5

6 6 Короткі відомості з техніки безпеки в лабораторії У мікробіологічній практиці широко застосовується посуд з хімічного скла. Треба бути обережним у поводженні з нею. Осколки розбитого посуду ретельно прибирати. При аналізах часто застосовуються міцні розчини лугів і кислот. Працювати з ними потрібно дуже обережно, так як ці речовини шкідливо діють на шкіру рук і одяг. Якщо кислота випадково пролилася, її треба засипати великою кількістю соди і потім кілька разів промити водою. Пролилася луг треба ретельно витерти, а предмети, на які вона потрапила, обробити слабким розчином оцтової кислоти. При попаданні кислот або лугів на шкіру людини їх необхідно негайно ж змити великою кількістю води. У мікробіологічної лабораторії мають справу з живими мікроорганізмами. Основні роботи ведуться стерильно, тобто працюють з однією культурою мікроорганізмів, яка не повинна заражатися сторонніми мікробами. Для попередження зараження посівів застосовують спеціальні методи стерилізації. Крім того, важливо дотримуватися чистоти в лабораторії. Посуд з культурами мікроорганізмів не повинна залишатися відкритою. Біомаса мікроорганізмів, якщо вона не потрібна для аналізів, викидається тільки після стерилізації в автоклаві. Посіви мікроорганізмів виробляють у полум'ї газового або спиртового пальника, тому слід остерігатися опіків, і перш за все акуратно підібрати довге волосся. Пальник має горіти тільки тоді, коли це необхідно. Якщо при посіві випадково загориться ватяна пробка, спиртівка або папір, вогонь гасять рушником. При більших осередках займання користуються вогнегасниками. Використані піпетки, предметні і покривні скла, шпателі і т.д. поміщають в посудину з дезинфікуючою рідиною. Студенти повинні постійно пам'ятати, що вони мають справу з мікроорганізмами, які далеко не завжди можуть бути безпечними, особливо в роботах по виділенню мікробів з об'єктів навколишнього середовища. Тому в кінці заняття студенти повинні привести в порядок робоче місце і вимити руки з милом.

7 При несправності електричної мережі потрібно вимкнути електроприлади і їх централізоване електроживлення. РОЗДІЛ 1. ЗАГАЛЬНА МІКРОБІОЛОГІЯ ТЕМА 1. Морфологія мікроорганізмів і методи її вивчення Мікробіологія вивчає організми, які мають мікроскопічні розміри, тобто вимірюються мікрометрами або частками мікрометрів. Один мікрометр дорівнює 10-6 метра і скорочено позначається мкм. Мікроорганізми характеризуються інтенсивним обміном речовин і здатні здійснювати різноманітні хімічні перетворення. Різні мікроорганізми відрізняються і за своєю будовою і по тим біохімічних процесів, які вони здійснюють. Об'єднання їх в одну групу викликано не тільки малими розмірами, а й спільністю методів культивування та дослідження. Для вивчення будови мікроорганізмів, їх зовнішнього вигляду, форми, розмірів, тобто для вивчення морфології мікроорганізмів, користуються мікроскопом. Найменші частинки, які вдається побачити в сучасні світлові мікроскопи, мають величину більш 1/3 довжини хвилі світла, тобто не менше 0,2 мкм, що пов'язано з використанням видимої частини світу, що має довжину хвилі від 0,4 мкм до 0,7 мкм. Пристрій мікроскопа На рис. 2 показаний зовнішній вигляд поширеного в науково-дослідної та навчальної практики мікроскопа МБІ-3. Розглянутий об'єкт препарат поміщається на предметний столик і висвітлюється знизу променями світла, які виходять з освітлювача, падають на дзеркало, потім проходять через конденсор і фокусується на препараті. Основні частини мікроскопа: окуляри, тубус, револьверна насадка з об'єктивами, предметний столик з зажимами для препаратів, конденсор, макро- мікрогвинти для наведення на різкість і, нарешті, штатив, в який все це вмонтовано. 7

8 Перед микроскопированием перевіряють правильність установки освітлення (по Кьолеру). Для цього, переміщаючи патрон освітлювача з лампочкою, домагаються чіткого зображення нитки 8

9 напруження лампи на закритій повністю діафрагму конденсора так, щоб це зображення повністю заповнювало отвір конденсора. Закривши діафрагму освітлювача, відкривають діафрагму конденсора і, переміщаючи конденсор, домагаються різкого зображення діафрагми освітлювача в поле зору мікроскопа. Щоб яскраве світло не сліпив очі, попередньо зменшують напруження нитки лампи. І, нарешті, зображення отвору діафрагми встановлюють в центрі поля зору, а діафрагму освітлювача відкривають так, щоб було освітлено все поле зору. Мікроскоп являє собою оптичну систему з двома ступенями збільшення: перше збільшення здійснюється об'єктивом, друге окуляром. Об'єктив дає збільшене зворотне зображення предмета, яке розглядається в окуляр. В результаті очей спостерігача бачить сильно збільшене зворотне зображення предмета. Тому рух об'єкта наліво сприймається оком як рух направо. Загальне збільшення мікроскопа, тобто збільшення, при якому розглядають об'єкт під мікроскопом, визначається як добуток збільшень об'єктива і окуляра. Об'єктиви дають збільшення в 10, 40, 60, 90 разів, окуляри в раз. Якщо застосовується бінокулярна насадка, вона дає додаткове збільшення. На рис. 3 показана принципова схема оптичної системи мікроскопа. Об'єктив Про утворює в площині Z дійсне перевернуте зображення А об'єкта А. Дається об'єктивом зображення збільшується далі за допомогою окуляра Е. Оскільки Z знаходиться в фокусі окуляра Е, спостерігач бачить збільшене уявне зображення А в площині Х, яка зазвичай розташовується в 25 см від ока , тобто на відстані, найбільш зручному для ближнього зору. Слід мати на увазі, що подібне уявлення про механізм утворення зображення є в надзвичайно спрощеним, бо воно ігнорує вплив дифракції та ряду інших факторів. У роботі з мікроскопом студенти вивчають препарати мікробів зі збільшенням в раз. Найбільше збільшення, яке дає оптичний мікроскоп, 3000 разів. Найменший розмір часток, які можна розглядати в такому мікроскопі, 9

10 дорівнює 0,2 мкм, що обумовлено довжиною хвилі видимої частини спектра. Морфологія мікроорганізмів Світ мікроорганізмів включає в себе величезну різноманітність форм, що не становлять єдину систематичну групу. Основними об'єктами мікробіології є бактерії, але крім них мікробіологи вивчають ще дріжджі, гриби, мікроскопічні водорості і деякі найпростіші. На рис. 4 представлені основні групи мікроорганізмів (за винятком найпростіших); співвідношення їх розмірів збережені. Всі живі організми, крім вірусів, мають клітинну будову. У відповідності зі своєю клітинної організацією вони діляться на прокаріотні і еукаріотні. 10

11 Головна відмінність еукаріот від прокаріотів полягає в наявності вторинних порожнин, що відокремлюють ядро \u200b\u200bі інші клітинні структури від цитоплазми. Саме поява вторинних порожнин дозволило здійснити стрибок в еволюції всього живого світу за рахунок збільшення внутрішньої поверхні мембран еукаріот. Це дало можливість відповідно до збільшення швидкості дифузії, одночасно здійснювати більшу кількість протікають на мембранах біохімічних реакцій. Прокариотами є бактерії, в тому числі актиноміцети і ціанобактерії. Еукаріотамі всі рослини, тварини, дріжджі, гриби, найпростіші. Серед прокаріотів в даний час виділяється група архей, яка включає в себе метаногенів, екстремальних галофили, (що живуть в дуже солоній воді) екстремально термофільних бактерій, що окислюють і відновлюють молекулярну сірку, а також термоплазма, позбавлених клітинної стінки. Новий поділ було зроблено на основі порівняння нуклеотидних послідовностей в малих відрізках Хвороби. 11

12 Архебактерії відрізняються за складом клітинних стінок, ліпідів і деяких інших фізіолого-біохімічних особливостей (наприклад, у них інший механізм фіксації СО 2). Таким чином, в будові клітинної організації в даний час виділяють 3 групи: архебактерии, (за новою номенклатурою Archaea, археї), еубактеріі (за новою номенклатурою Bacteria, бактерії), і еукаріоти (за новою номенклатурою Eukarya). Робота 1. Мікроскопічна вивчення бактерій Морфологія бактерій Теоретичне введення Ця група мікроорганізмів найбільш численна, широко поширена в природі і має велике промислове значення. Для найменування мікроорганізмів використовують бінарну номенклатуру, як в зоології та ботаніки. Відповідно до цієї номенклатурою кожен вид має назву, що складається з двох латинських слів. Перше слово означає рід, а друге вид. Родова назва завжди пишеться з великої літери, а видове з малої. Більшість бактерій одноклітинні організми сферичної, палочковидной або звивистою форми. Серед бактерій є невелика кількість нитчастих форм. Бактерії дуже малі, діаметр клітини кулястих бактерій складає 1 2 мкм. Розмножуються бактерії розподілом (при сприятливих умовах поділ відбувається через хв). Деякі бактерії рухливі. Здатність рухатися пов'язана з наявністю особливих органел джгутиків. Найбільш прості за формою кулясті бактерії (коки). Вони зустрічаються або в вигляді одиничних кульок, або кульок, зчеплених між собою. По розташуванню клітин після поділу кулясті бактерії поділяють на монококкі (поодинокі коки), тетракоккі (об'єднані по 4), сарціни (об'єднані по 8), стафілококи (грона), стрептококи (ланцюжки коків). 12

13 Паличкоподібні бактерії представляють собою найчисленнішу групу бактерій. Вони мають циліндричну форму клітин з округлими або загостреними кінцями і в сильному ступені розрізняються по відношенню довжини до ширини. Вони можуть розташовуватися поодинці або утворюють короткі або довгі ланцюжки. Палички можуть бути різної довжини, зазвичай кілька мкм, а ширина близько 1 мкм. Деякі паличкоподібні бактерії утворюють всередині клітини особливі тільця суперечки. Кожна клітина утворює одну спору, яка служить для перенесення несприятливих умов. Суперечки при відповідних умовах (температура, вологість, поживні речовини) проростає, перетворюючись в паличку. Стійкість бактеріальних спор перевершує стійкість будь-яких живих організмів. Наприклад, суперечки сінної палички Bacillus subtilis витримує температуру 100 Про С протягом 3 год. Така стійкість суперечка ускладнює боротьбу з інфекціями. Покручені мікроорганізми розрізняються за ступенем зігнутості клітин і по числу витків. Вони поділяються на вібріони, спірили і спірохети. Якщо у бактерії один неповний завиток спіралі, то вона називається вібріоном. Якщо бактерія має кілька спіралеподібних завитків, то її називають спірили, а мікробів, що мають звиту форму з великою кількістю дрібних завитків, називають спірохетами. Нитчасті бактерії представляють собою нитки, що складаються з циліндричних або дисковидних клітин. Нитки деяких видів укладені в слизову оболонку, яка може бути просякнута гидроокисью заліза або солями марганцю. Процес акумуляції важких металів з розчинів відбувається в клітинах деяких железобактерий. Великі нитчасті бактерії р. Beggiatoa відкладають в клітках сірку. Нитчасті бактерії живуть зазвичай в морських і прісних водах, зустрічаються також в розкладаються органічних залишках, в кишечнику тварин. До ціанобактеріям відноситься велика група організмів, що поєднують Прокаріотних будова клітини зі здатністю здійснювати фотосинтез. Пігменти клітин ціанобактерій крім хлорофілу а (зеленого кольору) містять фикоцианин пігмент 13

14 синього кольору. За цією ознакою раніше їх називали синьо-зелених водоростей. Більшість з них багатоклітинні організми, що представляють собою довгі, найчастіше неразвлетвленние нитки (трихоми). Клітини в нитках об'єднані спільною зовнішньою стінкою. Іноді утворюють слизисті скупчення «мати». Розмноження здійснюється шляхом розпаду нитки на окремі ділянки. Деякі види пересуваються ковзанням (р. Spirulina). Актиноміцети (розгалужені бактерії, променисті грибки) велика група прокариотних мікроорганізмів, яка утворює тонкі розгалужені нитки довжиною в кілька міліметрів і діаметром 0,5 1,5 мкм. Вони є своєрідною групою мікроорганізмів, яка в морфологічному відношенні має схожість з пліснявими грибами (рис. 5). Клітини значної частини представників цієї групи здатні гілкуватися, що є характерною ознакою грибів. Однак довжина розгалужених ниток актиноміцетів досягає декількох міліметрів, тоді як довжина міцелію грибів декількох сантиметрів. Гіфи грибів зазвичай в кілька разів товщі ниток актиноміцетів. За морфології і розвитку актиноміцети розділяються на вищі і нижчі форми. До вищих належать організми з добре 14

15 розвиненим септірованного або несептірованним міцелієм і особливими органами спороношения. Спори утворюються у вигляді ланцюжків на спеціальних спороносящих гифах повітряного міцелію. Будова органів спороношення різному в різних видів: довгі чи короткі, прямі або спіралеподібні (рис. 6). За наявності міцелію і будовою органів спороношення вищі актиноміцети нагадують міцеліальні гриби. Деякі актиноміцети мають міцелій тільки в молодий культурі, який з віком розпадається з утворенням паличковидних і коккоподібних клітин. Нижчі форми актиноміцетів не мають справжнього міцелію. Здатність до утворення міцелію виражена у них лише в тенденції клітин до розгалуження. До нижчих актиноміцетам відносяться, наприклад, види роду Mycobacterium, які мають властивість змінювати форму клітин з віком культури (рис. 7). Це властивість називається плеоморфізм. Серед вищих актиноміцетів провідне місце за чисельністю в природних середовищах займають види роду Streptomyces. Актиноміцети грають велику роль в процесах 15

16 грунтоутворення і створення родючості грунтів. Актиноміцети руйнують складні органічні сполуки (целюлозу, гумус, хітин, лігнін та ін.), Недоступні багатьом іншим мікроорганізмам. Майже всі види роду Streptomyces утворюють специфічні продукти життєдіяльності, які мають антибіотичні властивості. Деякі види є збудниками захворювань рослин, тварин і людини. Крім основних форм бактерій існують cтебельковие і бактерії, що брунькуються, що несуть вирости, що отримали назву простекі. (Рис.8) 16

17 Функції простекі різні. У деяких бактерій вони служать для розмноження, у інших для прикріплення клітини до субстрату. 17

18 18 Практична частина Мета роботи вивчити морфологію представників бактерій Порядок виконання роботи Виконуючи першу роботу, студенти вчаться поводженню з мікроскопом, переглядають готові препарати представників бактерій, потім самостійно готують препарати живих бактерій і проводять мікроскопію їх. Спочатку студенти проводять мікроскопію готові фіксовані препарати бактерій. Фіксовані препарати є мікроорганізми, суспендовані у водному середовищі, висушені на предметному склі і пофарбовані аніліновими барвниками. Препарати деяких живих мікроорганізмів студенти готують самостійно. Для цього на чисте предметне скло наноситься невелика крапля водопровідної води, в яку прокаленной і охолодженої бактеріологічною петлею вноситься невелика кількість досліджуваних мікробів, ретельно розмішується і накривається покривним склом. Надлишок води знімається фільтрувальної папером. Препарат поміщається на предметний столик і закріплюється зажимами. Спочатку, дивлячись в окуляр і обертаючи макровінт, домагаються різкого зображення об'єкта при малому збільшенні з об'єктивом 10х. Потім переводять мікроскоп на велике збільшення з об'єктивом 40х. Обертання гвинтів треба виробляти з обережністю, так як при занадто різкому опусканні можна розчавити лінзи об'єктивом. При мікроскопірованіі слід мати на увазі, що мікроскоп, особливо при великих збільшеннях, захоплює всієї глибини об'єкта, тому при поступовому опусканні тубуса з допомогою мікровінта об'єкт видно спочатку зверху, а потім в оптичному розрізі. 1. Перегляд фіксованих препаратів мікроорганізмів. Lactococcus lactis збудник молочнокислого бродіння; форма клітин куляста коки; клітини з'єднані в ланцюжки. Використовується для отримання молочнокислих продуктів.

19 Lactobacillus acidophilum паличкоподібні бактерії; збудник молочнокислого бродіння. Використовується для отримання молочнокислих продуктів. Acetobacter aceti паличкоподібні бактерії, що окислюють етанол в оцтову кислоту. Використовується для отримання харчового оцту. Streptomyces griseus актиноміцет, форма клітини у вигляді тонких розгалужених ниток; продуцент антибіотика стрептоміцину. Saccacharopolyspora erythrae актиноміцет, форма клітини у вигляді тонких розгалужених ниток; продуцент антибіотика еритроміцину. 2. Перегляд живих препаратів Bacillus subtillis форма клітин в вигляді тонких рухливих паличок; утворює спори; продуцент ферментних препаратів. Spirulina platensis ціанобактерій; форма клітин у вигляді одиночної нитки, що складається з циліндричних клітин, щільно прилеглих один до одного; володіє ковзаючим рухом. Застосовується у вигляді харчової добавки. Зміст звіту 1. Латинська назва мікроорганізму. 2. Морфологія клітини (дати малюнок із зазначенням збільшення мікроскопа і зберігаючи співвідношення розмірів клітин). 3. Використання досліджуваних бактерій в промисловості. Контрольні питання 1. Опишіть пристрій мікроскопа. 2. Як визначити збільшення мікроскопа? 3. Яка форма клітин бактерій. 4. Назвіть особливості морфології актиноміцетів. 5. Яких представників бактерій Ви знаєте і яке їхнє практичне значення? Робота 2. Морфологія еукаріотних мікроорганізмів Теоретичне введення 19

20 До еукаріотні мікроорганізмам, які вивчаються микробиологами, відносяться: гриби, дріжджі, мікроводорості і деякі найпростіші. Морфологія грибів Гриби безхлорофільні мікроорганізми, які мають ниткоподібну форму клітин. Довгі розгалужені нитки, утворені ними, називаються гіфами. Гіфи в сукупності утворюють міцелій. За своїми розмірами гіфи грибів набагато більші актиноміцетів. Міцелій у ряду цвілевих грибів розділений перегородками (септірованний міцелій), а інших видів перегородки відсутні. У біотехнології як продуцентів, в основному, використовуються цвілеві гриби. Під назвою «цвілеві гриби» об'єднуються деякі представники фікоміцетів, сумчастих і недосконалих грибів. На щільних субстратах цвілеві гриби утворюють округлі пухнасті, павутиноподібні, ватоподобние або порошкоподібні колонії зеленого, жовтого, чорного або білого кольору. Колонії цвілі складаються з великої кількості гіфів. Велика частина гіфів розвивається в повітрі, а частина в товщі субстрату. На гифах часто утворюються конідієносци, на яких суперечки утворюються або всередині спорангия або у вигляді Екзоспори розташованих ланцюжками. Конідіеспори, або конідії, служать для безстатевого розмноження (Рис. 10). Конідії, потрапляючи в сприятливі умови, проростають в міцелій. Пліснява дуже широко поширені в природі і мають потужний ферментативний апарат. Тому вони є основними деструкторами органічних сполук в природі. Пліснява також широко використовуються в промисловості для отримання органічних кислот, антибіотиків і ферментів. 20

21 Морфологія дріжджів Дріжджі є окрему групу одноклітинних мікроскопічних грибів, що мають велике практичне значення. Дріжджові клітини являють собою великі клітини округлої або овальної форми (рис. 11). Деякі дріжджі можуть утворювати рудиментарний міцелій, який називається «псевдомицелий». Розмір клітин коливається від 3 мкм до 10 мкм в довжину і від 2 до 8 мкм в ширину. Більшість дріжджів розмножуються брунькуванням. При цьому на 21

22 поверхні клітини з'являється невелика опуклість нирка (іноді не одна, а кілька), поступово збільшується в розмірах і, нарешті, відокремлюється від виробляє її клітини. Відокремилася від материнської клітини нирка стає новою дріжджовий клітиною. Деякі дріжджі розмножуються поділом. У мелкозернистом вмісті живих дріжджів (протоплазмі) добре помітні великі вакуолі. Вакуолі являють собою порожнини всередині протоплазми, заповнені клітинним соком. Він складається з розчинених у воді електролітів, білків, вуглеводів і ферментів. У молодих дріжджових клітинах протоплазма гомогенна, а на більш пізніх стадіях розвитку в протоплазмі з'являються вакуолі, заповнені клітинним соком з продуктами обміну речовин. При виснаженні живильного середовища у багатьох дріжджів настає спорообразование. У деяких видів дріжджів суперечки округлої форми і покриті гладкою оболонкою. У сприятливих умовах спори проростають. Дріжджі широко поширені в природі. Вони зустрічаються на винограді, на інших ягодах і фруктах, в молоці, в воді і грунті, а також на шкірі людини. Багато дріжджі здійснюють спиртове бродіння і застосовуються для виробництва спирту в хлібопеченні, виноробстві, пивоварінні. 22 Морфологія найпростіших Найпростіші являють собою одноклітинні організми тваринного світу. Серед мікроорганізмів вони є найбільш складно влаштованими, що мають примітивні органи, властиві багатоклітинних тварин. У деяких з них є ротовий і анальний отвори, скоротливі і травні вакуолі. Розмножуються найпростіші безстатевим (поділом клітини) і статевим шляхом. Класифікація найпростіших заснована на способах руху. 1. Саркодовие. Пересуваються і захоплюють їжу за допомогою псевдоподий, або помилкових ніжок. Типовим представником є \u200b\u200bAmoeba. Розміри амеб не перевищують мкм.

23 2. Жгутикові. Мають щільну плазматическую оболонку і пересуваються за допомогою джгутиків. Грунтові форми джгутиків дуже дрібні (2 5 мкм), а водні великі (до 20 мкм). Типовим представником є \u200b\u200bEuglena. 3. війчасті. Найбільш високоорганізовані найпростіші. Розміри клітин коливаються від 20 до 80 мкм. Типовим представником є \u200b\u200bінфузорія-туфелька Paramecium, яку культивують на корм малька риб. 4. Споровики. Нерухомі форми. Багато патогенні, наприклад збудник малярії Plasmodium. Найпростіші широко поширені в природі. Вони зустрічаються у водоймах, в мулі і грунті. Значення найпростіших у природі вельми різноманітно. Вони живуть в шлунково-кишковому тракті різних тварин, беручи участь у перетравлюванні рослинної їжі, беруть участь в мінералізації органічних залишків в грунті, а також є важливою складовою частиною біоценозу в очисних спорудах. Харчуючись бактеріями і зваженими речовинами, вони сприяють освітленню води. Найпростіші виконують функцію індикаторів: з розвитку тих чи інших форм можна судити про якість очищення стоків. Так, переважання амеб і відсутність у складі активного мулу інфузорій свідчить про погану роботу очисних споруд. Інфузорія Tetrahymena широко використовується для первинної оцінки токсичності. Різні види найпростіших представлені на рис. 12. Морфологія водоростей Водорості являють собою велику групу рослинних організмів. Загальна для всіх них наявність хлорофілу і обумовлене цим фотоавтотрофної харчування здатність синтезувати органічні речовини, використовуючи енергію сонячного світла і вуглекислий газ. У багатьох водоростей зелене забарвлення хлорофілу замаскована іншими пігментами. Серед них зустрічаються дуже дрібні одноклітинні і багатоклітинні форми, що відносяться до мікроорганізмів, а також 23

24 багатоклітинні організми, що мешкають в морях і океанах і досягають іноді гігантських розмірів .. Об'єктами вивчення мікробіології є деякі водорості мікроскопічних розмірів. Вони мають різноманітну форму і живуть як на суші, так і у водному середовищі (рис. 13). 24

25 Практична частина Мета роботи вивчити морфологію представників різних груп еукаріотів. Порядок виконання роботи Студенти самостійно готують живі препарати представників грибів, дріжджів, водоростей і найпростіших; микроскопируют їх з об'єктивом х40 і замальовують із зазначенням збільшення мікроскопа. Пліснява Aspergillus niger форма клітин у вигляді міцелію з перегородками; на деяких гифах є нерозгалужені конідієносци зі спорами. Конідієносці одноклітинні, шаровидно роздуті, на поверхні здуття розташовані короткі кеглеобразная клітини (стеригмами), кожна з яких отшнуровиваться по ланцюжку конідій, забарвлених в чорний колір. Застосовується для отримання органічних кислот і ферментів. Penicillium chrysogenum гіфи мають перегородки; на деяких гифах є розгалужені конідієносци зі спорами. Конідії утворюються на кінцях мутовчато розгалужених конидиеносцев. Застосовується для отримання антибіотика пеніциліну. 25

26 Дріжджі Saccharomyces cerevisiae поодинокі дріжджі з овальними і округлими клітинами; розмножуються брунькуванням. Застосовуються в пивоварінні, хлібопеченні, виробництві спирту. У природі зустрічаються на поверхні ягід та інших плодів. Saccharomyces vini форма клітин овальна і округла; розмножуються брунькуванням; після брунькування деякий час не відокремлюються, утворюючи невеликі «гілочки». Застосовуються в виноробстві. Rhodotorula glutinis форма клітин еліптична; клітини поодинокі; розмножуються брунькуванням. Пофарбовані в оранжевий колір завдяки вмісту в клітинах каротиноїдів. Можуть рости в середовищах з вуглеводнями нафти в якості джерела вуглецю. Використовуються як кормові дріжджі. Candida tropicalis дріжджі з овальними і сильно витягнутими клітинами, що утворюють «псевдомицелий». Можуть рости в мінеральному середовищі з вуглеводнями в якості джерела вуглецю. Використовуються як кормові дріжджі. У промисловому масштабі вирощуються на відходах виробництва спирту, паперу. Водорості Chlorella vulgaris мікроскопічна зелена водорість, має округлі клітини (5 10 мкм в діаметрі); розмножуються автоспори, які формуються всередині материнської клітини в кількості від 4 до 32 і звільняються після розриву її оболонки. Можуть застосовуватися для масового культивування з метою отримання кормового білка, а також для регенерації повітря в замкнутих системах (підводні човни, космічні станції і т.д.). Scenedesmus sp. відноситься до групи зелених водоростей; має овальну форму клітин; зовнішні клітини часто бувають із загостреними кінцями; клітини з'єднані разом по чотири. Застосовується для отримання харчового білка. 26

27 Найпростіші Препарат готується з активного мулу аеротенках. Вивчити морфологію виявлених представників найпростіших і замалювати їх. Зміст звіту 4. Латинська назва мікроорганізму. 5. Морфологія клітини (дати малюнок із зазначенням збільшення мікроскопа і зберігаючи співвідношення розмірів клітин). 6. Використання досліджуваних мікроорганізмів в промисловості. Контрольні питання 1. Опишіть форму клітин представників грибів та їх практичне використання. 2. Опишіть форму клітин дріжджів; назвіть представників, і розкажіть про їх практичному використанні. 3. Розкажіть про морфології мікроводоростей і їх практичному використанні. 4. Назвіть представників найпростіших і розкажіть про їх застосування в біотехнології. Робота 3. Методи вивчення морфології мікроорганізмів Найпоширенішим методом вивчення морфології бактерій є мікроскопірованіе фіксованих препаратів, приготованих з чистих культур мікроорганізмів або з досліджуваної проби. Дослідження мікроорганізмів в живому стані застосовується при вивченні більших форм і спостереженні рухливості клітин. Приготування фіксованих препаратів мікроорганізмів Для приготування фіксованих препаратів мікроорганізмів спочатку готують мазок, висушують його, фіксують, а потім фарбують. Мазки готують на абсолютно чистих предметних стеклах. Знежирювати скла можна етиловим спиртом, сумішшю рівних обсягів спирту та ефіру і іншими 27

28 рідинами. Найпростішим і практично зручним способом знежирення стекол є протирання їх по обидва боки шматочком господарського мила. Мило видаляють зі скла шматочком сухої вати або серветкою. При виготовленні мазка з колонії бактерій, вирощених на агаризованому середовищі, спочатку наносять на знежирене скло краплю води або фізіологічного розчину. Потім прокаливают бактеріологічну петлю в полум'я пальника. Після цього, охолодивши петлю на внутрішній стінці пробірки, захоплюють частину колонії без агару петлею. Петлю з культурою вносять в краплю води або фізіологічного розчину на склі і роблять 2 3 кругових руху. Частина бактерій суспендується в рідини. Надлишок бактерій, які залишилися на петлі, спалюють у полум'ї пальника, нагріваючи петлю до червоного. Потім охолодженої петлею розмазують краплю суспензії по склу. Площа мазка повинна бути в діаметрі 1,5 2 см. Мазок повинен бути тонким з рівномірним розподілом матеріалу. Якщо мазок готують з культури, вирощеної на рідкому поживному середовищі, то, дотримуючись ті ж правила стерильності, набирають краплю культури петлею або піпеткою і наносять її на середину знежиреного скла. Піпетку з залишком культури занурюють в посудину з дезинфікуючим розчином. Краплю рівномірно розподіляють по склу бактеріологічною петлею. Петлю пропалюють в полум'я пальника і ставлять в штатив або в стакан. Мазок висушують на повітрі або в струмені теплого повітря, тримаючи його за поздовжні ребра високо над полум'ям пальника. Межі мазка окреслюють восковим олівцем на звороті скла, а з боку мазка на одному з кінців скла ставлять номер препарату. За цих позначок легко можна орієнтуватися в місці розташування мазка на склі. Висушений мазок фіксують. Фіксація переслідує такі цілі: 1) вбити мікробів, що робить препарат безпечним при подальшій роботі; 2) прикріпити мікробів до скла, щоб вони не змилися при фарбуванні і промиванні водою; 3) поліпшити сприйнятливість фарб. 28

29 Найбільш простим, придатним майже для всіх мікробіологічних об'єктів і найпоширенішим в практиці методом є фіксація в полум'я пальника. Для цього предметне скло проводять 3 4 рази через найбільш гарячу верхню частину полум'я пальника, не допускаючи зайвого перегрівання препарату, щоб не викликати денатурації білка і порушення структури і морфології бактерій. Розрізняють прості і складні диференціальні методи забарвлення. Простий забарвленням користуються для виявлення в досліджуваному матеріалі мікробів, визначення їх кількості, форми і розташування. Просте фарбування полягає в нанесенні на препарат якоїсь однієї аніліновою фарби. Найчастіше для цих цілей використовується фуксин червоне забарвлення, а також лужної розчин метиленової синьки (синька Лефлера) блакитне забарвлення. Техніка забарвлення: добре зафіксований препарат поміщають мазком догори на скляний місток над ванною. На поверхню мазка піпеткою або з крапельниці наносять одну з певної фарби. Фуксин витримують на мазку 1 3 хв, а синьку 3 5 хв. Фарбу з мазка зливають, препарат промивають водою, висушують на повітрі або обережно промокають фільтрувальної папером. На висушений мазок наносять краплю иммерсионного масла, поміщають препарат на предметний столик мікроскопа і проводять мікроскопію з іммерсійним об'єктивом (90) в прохідному світлі. Диференціальні способи забарвлення бактерій. Складні методи забарвлення мають велике значення при визначенні та диференціації різних видів мікробів. Вони засновані на особливостях фізико-хімічної будови мікробної клітини і застосовуються для детального вивчення структури клітини і виявлення характерних ознак по відношенню до деяких барвників. При цих методах мазок забарвлюють декількома фарбами і додатково обробляють протравами або обесцвечивающими речовинами спиртом, кислотою і ін. До цих методів відносять найважливіший метод забарвлення для диференціації бактерій забарвлення по Граму. При цьому методі виявляється 29

30 здатність бактерій утримувати барвник або знебарвлюватися в спирті, що пов'язано з хімічною структурою клітинної стінки. Всі бактерії за будовою клітинної стінки діляться на дві групи: 1) фарбувальні по Граму грампозитивні і 2) не прикрашають по Граму грамнегативні. Ставлення до фарбування за Грамом є настільки важливим диференціальним ознакою бактерій, що обов'язково згадується при їх характеристиці і служить таксономическим ознакою. 30 Методика забарвлення по Граму На фіксований мазок кладуть смужку фільтрувального паперу, заздалегідь просоченої генціанвіолетом. На смужку наносять 3 5 крапель водопровідної води. Через 1 2 хв папірець видаляють пінцетом, а на препарат наливають розчин Люголя. Через 30 сек 1 хв зливають розчин Люголя. Наносять кілька крапель 96 Про -ного спирту. Знебарвлюють протягом 1 хв до зникнення сероватофіолетових цівок. Препарат промивають водою. На мазок наливають фуксин і витримують 1 2 хв. Фарбу зливають, препарат промивають водою, висушують фільтрувальним папером. Мікроскопують з иммерсионной системою. Грампозитивні бактерії забарвлюються в фіолетово-синій (наприклад, паличка маслянокислого бродіння Clostridium pasteurianum), а грамнегативні в рожево-червоний колір (кишкова паличка Escherichia сoli). Крім цієї традиційної методики фарбування по Граму є швидкий і простий метод для диференціації по Граму без фарбування. Клітини бактерій (краще 1 2-добові) поміщають петлею в краплю 3% -ного KOH на предметне скло, розмішують круговими рухами і через 5 8 із петлю різко піднімають. Суспензія грамнегативнихбактерій стає в'язкою і тягнеться за петлею, утворюючи слизові тяжі. Грампозитивні бактерії рівномірно розподіляються в краплі лугу (як у воді). Реакція вважається негативною, якщо освіти слизових тяжів не спостерігається протягом 60 с. Збільшення в'язкості викликано лізисом клітинних стінок грамнегативних бактерій в розчині

31 лугу і звільненням ДНК. Метод диференціації бактерій за Грамом без фарбування слід використовувати лише для попередньої діагностики, або підрахунку зразкового співвідношення колоній грам позитивних та грам бактерій. Виявлення живих і мертвих клітин методом забарвлення метиленової синню Число живих і мертвих клітин можна визначити методом забарвлення розчином метиленової сині. Метод заснований на різної проникності живих і мертвих клітин мікроорганізмів. Клітинна проникність у мертвих клітин порушується, тому барвник вільно проходить крізь цитоплазматичну мембрану і адсорбується протоплазми. Під мікроскопом мертві клітини виглядають синіми, живі безбарвними або бледноголубой. Забарвлення здійснюється наступним чином: на предметне скло наноситься крапля 2% розчину метиленової сині, покривається покривним склом, надлишок фарби відтягується шматочком фільтрувального паперу. Препарат проглядається під мікроскопом, в 10 полях зору вважають кількість живих і мертвих клітин; число мертвих клітин виражається в%. Приклад: середнє число живих клітин в одному полі зору 10, середнє число мертвих клітин в одному полі зору 5, загальне число клітин в одному полі зору клітин 100% 5 клітин Х Х 33,3% 15 Таким чином, число мертвих клітин в досліджуваній суспензії мікроорганізмів склало 33,3%. Визначення розмірів клітин Для визначення розмірів клітин мікроорганізмів необхідно мати спеціальний окуляр зі шкалою (окулярний мікрометр) і об'єкт-мікрометр. Окулярний мікрометр, в 31

32 найпростішому випадку, являє собою скляний диск з нанесеною на ньому лінійною шкалою, який вкладається в окуляр (мал. 14а). Об'єкт-мікрометр являє собою предметне скло, в центрі якого викарбувано лінійна шкала довжиною 1 мм, з ціною поділки 10 мкм. Перед вимірюванням необхідно визначити ціну поділки окулярного мікрометра для кожного збільшення мікроскопа. Для цього об'єкт-мікрометр поміщається на предметний столик мікроскопа і розглядається як препарат; при цьому одна з видимих \u200b\u200bподілів об'єкт-мікрометра поєднується з нульовою відміткою шкали окулярного мікрометра і відзначається збіг розподілів тієї та іншої шкали (рис. 15). Підраховують, скільки окулярних і об'єктивних поділів доводиться на цей відрізок, і обчислюють ціну поділок окулярного мікрометра. Якщо після цього помістити на предметний столик препарат мікроорганізмів замість об'єкт-мікрометра і розглядати його 32

33 при тому ж збільшенні, то можна виміряти величину мікробної клітини, користуючись шкалою окулярного мікрометра як лінійкою. Для точних вимірювань застосовується спеціальний окулярний мікрометр з ковзаючою нульовою відміткою, пов'язаної з вимірювальним барабаном (рис. 14б). Він дозволяє визначити розміри мікроорганізмів з точністю до десятих часток мікрона. Нульовою відміткою служить подвійна вертикальна лінія, середина якої відповідає перетину двох тонких ліній у вигляді хреста. Перед вимірами необхідно дізнатися ціну поділки шкали вимірювального барабана. Еталоном служить об'єкт-мікрометр. Обертаючи вимірювальний барабан, нульовою відміткою обводять кілька поділок шкали об'єкт-мікрометра. Подвійна вертикальна лінія показує число повних обертів вимірювального барабана. Проводячи вимірювання мікроорганізмів, пересувають нульову позначку уздовж об'єкта і вважають свідчення вимірювального барабана. Практична частина Мета роботи освоїти основні методи вивчення морфології мікроорганізмів. 33

34 Порядок виконання роботи 1. Приготувати фіксовані препарати молочнокислих бактерій з біокефіру і ацидофилина. 2. Виконати забарвлення по Граму клітин Bacillus subtilis (грам +) і Escherichia coli (грам-). 3. Визначити розміри дріжджових клітин Saccharomyces cerevisiae. 4. Визначити число живих і мертвих клітин Saccharomyces cerevisiae в суспензії дріжджів. 34 Зміст звіту 1. Морфологія клітин молочнокислих бактерій (малюнки фіксованих препаратів молочнокислих бактерій із зазначенням збільшення мікроскопа). 2. Малюнки фіксованих препаратів грамнегативних і грампозитивних бактерій. 3. Визначення ціни поділки вимірювального барабана окулярного мікрометра. 4. Розміри дріжджової клітини Saccharomyces cerevisiae. 5. Число живих і мертвих клітин в суспензії дріжджів. Контрольні питання 1. Як приготувати фіксований препарат бактерій? 2. З чим пов'язана різниця бактерій в забарвленні по Граму? 3. У чому полягає метод забарвлення за Грамом? 4. Як визначити розмір мікроорганізмів? 5. Як визначити кількість живих і мертвих клітин мікроорганізмів методом забарвлення метиленової синню? Тема 2. Культивування мікроорганізмів: принципи складання поживних середовищ; методи стерилізації; методи посівів і пересівань мікроорганізмів. Класифікація та приготування поживних середовищ Культивувати мікроорганізми це означає штучно створювати умови для їх росту. для культивування

35 мікроорганізмів в лабораторії або в промисловості застосовуються живильні середовища, що містять всі необхідні для життєдіяльності мікроорганізмів речовини. З навколишнього середовища поживні речовини надходять в клітину мікроорганізму, а з клітини в середу виводяться продукти обміну. Для життєдіяльності мікроорганізмів необхідні вода, вуглець, кисень, азот, сірка, фосфор, калій, кальцій, магній, залізо і мікроелементи. Всі ці речовини повинні міститися в живильному середовищі. Навіть без одного з них зростання або зовсім не буде або він буде незначним. Вуглець, водень, азот, фосфор і сірка називаються біогенними елементами, так як на їх частку припадає близько 90 95% сухої маси клітин. Калій, магній, кальцій і натрій називаються макроелементами, або зольними елементами. На їх частку припадає до 5 10% сухої маси клітин. Залізо, марганець, молібден, кобальт, мідь, ванадій, цинк, нікель і деякі інші катіони важких металів називаються мікроелементами і становлять частки відсотка сухої маси клітин. найбільше значення для будь-якого живого організму має вуглець. Він входить до складу всіх органічних молекул в клітині і на його частку припадає близько 50% сухої біомаси. По відношенню до вуглецю все організми діляться на автотрофні і гетеротрофні. Автотрофи як джерело вуглецю використовують вуглекислий газ. Гетеротрофи потребують готових органічних сполуках. Джерелом вуглецю для більшої частини мікроорганізмів можуть служити різні органічні речовини: білки і продукти їх розпаду, вуглеводи, жири, вуглеводні. Азотне живлення за своїм значенням стоїть на другому місці після вуглецевого. Азот входить до складу амінокислот і інших клітинних компонентів, які забезпечують життєздатність організмів. Азот становить 14% від сухої речовини клітин. Джерелом азоту служать азотсодержащие органічні або мінеральні сполуки. Джерелами мінерального азоту найчастіше є солі амонію і нітрати. В якості органічних джерел азоту використовуються білки, амінокислоти, нуклеотиди. Деякі прокаріоти можуть використовувати атмосферний азот. 35

36 Фосфор і сірка входять до складу важливих біополімерів клітини. Фосфор (3% сухої речовини клітин) входить до складу нуклеотидів і АТФ, а сірка (менше 1%) до складу деяких амінокислот. Як джерело фосфору зазвичай використовують фосфати, а сірки сульфати. Фосфор і сірка можуть також використовуватися у вигляді органічних сполук. Для росту мікроорганізмів потрібні в невеликих кількостях макроелементи: іони лужних металів (Na +, K +) і лужноземельних металів (Mg 2+, Ca 2+), які відіграють важливу роль в життєдіяльності мікроорганізмів. Макроелементи в клітинах бактерій необхідні для регулювання проникності, осмотичного тиску, величини рн. Крім цих металів, для росту мікробів необхідний ряд елементів в невеликій кількості (мікроелементи). Мінеральний склад живильного середовища формує розподіл електричних зарядів на поверхні клітини. Зміна електричного потенціалу клітин може змінити їх фізіологічну діяльність. Одна з основних функцій мікроелементів участь в ферментативном каталізі. В даний час дія четвертої частини всіх ферментів в клітці пов'язують з металами. Крім основних компонентів живильного середовища для нормального розвитку деяких мікробів необхідні ще додаткові речовини, які носять назву «факторів росту». Фактори зростання це об'єднана назва різних за хімічною природою з'єднань. Головним чином це органічні речовини, додавання яких в дуже незначних кількостях стимулює зростання і розмноження мікроорганізмів. Вони мають для мікробів те ж значення, що вітаміни для вищих організмів. Ростовими факторами в основному є вітаміни групи В, які грають роль регуляторів і стимуляторів обміну речовин у бактерій, або амінокислоти. Як фактори росту використовують дріжджовий автолізат, дріжджовий екстракт, нативні білки (кров, сироватка) і ін. Потреби в джерелах живлення мікроорганізмів досить різноманітні. З цієї причини не існує універсальної 36

37 середовища, однаково придатною для культивування будь-якого мікроорганізму. Залежно від цілей культивування і потреб даного мікроорганізму поживні середовища розрізняються за трьома ознаками: за складом, фізичним станом і призначенням. За складом живильні середовища поділяються на дві групи: 1) природні (натуральні); 2) штучні (синтетичні). Природними називаються середовища, що мають невизначений хімічний склад, так як в них входять продукти рослинного або тваринного походження, відходи різних виробництв, що містять органічні сполуки. Природні поживні середовища забезпечують інтенсивне зростання найрізноманітніших мікроорганізмів. Вони містять багатий набір органічних і неорганічних сполук, в тому числі всі необхідні елементи і додаткові речовини. Наприклад, в лабораторних умовах найчастіше використовуються наступні поживні середовища. 1. М'ясо-пептони бульйон (МПБ) екстракт з м'яса, містить продукти неповного розпаду білка пептони, в яких є органічний вуглець, органічний азот, містять фосфор, сірковмісні органічні речовини. У МПБ містяться також усі необхідні мікроорганізмам мінеральні речовини. МПБ застосовується при вирощуванні багатьох видів бактерій. 2. Пивне сусло екстракт з пророслих зерен ячменю, містить в якості джерела вуглецю цукру (в основному мальтозу), азотисті речовини, зольні елементи, різні ростові фактори і вітаміни групи В. Пивне сусло є хорошим середовищем для розвитку багатьох мікроорганізмів, зокрема дріжджів, цвілевих грибів. Хорошими природними середовищами є молоко, картопля, відвари з плодів і овочів. У промисловості зазвичай застосовують напівсинтетичні або природні середовища. Дуже часто в якості джерела вуглецю використовують відходи мікробіологічної або харчової промисловості: Меляса (відхід цукрового виробництва), 37

Міністерство сільського господарства Російської федерації АГЕНСТВО з рибальства Камчатський державний технічний університет КАФЕДРА БІОЛОГІЇ І ХІМІЇ ХІМІЯ І МІКРОБІОЛОГІЯ ВОДИ ПРИГОТУВАННЯ

Прізвище Шифр \u200b\u200bІм'я Робоче місце Район Шифр \u200b\u200bРазом: Завдання практичного туру регіонального етапу XXXII Всеросійської. БІОХІМІЯ. ІДЕНТИФІКАЦІЯ ЕКСТРАКТІВ Устаткування: Пробірки (3 пробірки з екстрактами

Прізвище Шифр \u200b\u200bІм'я Район / місто Робоче місце Шифр \u200b\u200bРазом: ЗАВДАННЯ практичного туру регіонального етапу XXVIII Всеросійської олімпіади школярів з біології. 2011-12 уч. рік. 11 клас БІОХІМІЯ. устаткування,

МІКРОБІОЛОГІЯ Пояснювальна записка До РОБОЧОЇ ПРОГРАМІ КУРСУ «Мікробіологія», 9 клас »на основі авторської програми елективного курсу« Мікробіологія »Аверчінковой О.Є Біологія. курси за. лікувальна

ЗАВДАННЯ МІКРОБІОЛОГІЯ (мах. 20 балів) Мета роботи: Приготувати і проаналізувати препарати з двох відомих кисломолочних продуктів. Устаткування: Мікроскопи, пальники або спиртівки, предметні скельця,

ЦАРСТВО прокаріотів ПОДЦАРСТВО БАКТЕРИИ Бактерії відносяться до прокаріотів. Це найпростіші, найбільш дрібні і широко поширені організми, які існують на землі понад 2 млрд. Років, але разом

система органічного світу Всі існуючі на Землі організми розділені на чотири царства: дробянки, Гриби, Рослини, Тварини. Дробянки відносяться до прокаріотів (доядерних організмам), гриби, рослини,

Тема проекту Дослідження мікроорганізмів, що мешкають в стоячій водоймі Бутовського лісу міста Москви Автор (и): Касаева Діана, Касаева Христина, Ткаченко Аліса Школа: ГБОУ ЗОШ 1 945 Клас: 5 клас Керівник:

Лабораторна робота «Будова тел шапинкових грибів» Мета: вивчити будову тіл шапинкових грибів Устаткування: шапинкових грибів (білий гриб, сироїжка, печериця, підберезник, маслюк, опеньок і ін.), Готові

ДЕРЖАВНА освітня установа вищої професійної освіти «ОМСКИЙ ДЕРЖАВНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ П.Столипіна» ІНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ І БІОТЕХНОЛОГІЇ

Стверджую Заступник Головного державного санітарного лікаря Російської Федерації - Головний лікар Федерального центру держсанепіднагляду МОЗ Росії Е.Н.БЕЛЯЕВ 20 лютого 2004 р N 24ФЦ / 900 Дата

Дослідницька робота Дріжджі: захоплююча життя маленьких грибів Автор роботи: учень 5 «Б» класу ГБОУ Гімназія 1748 «Вертикаль» Кутайцев Георгій Валерійович Керівник: Носова Олена Володимирівна,

Метод виявлення дріжджів і цвілевих грибів в харчових продуктах МЕТОДИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ Методи виявлення дріжджів і цвілевих грибів в харчових продуктах .: Методичні рекомендації М .: Федеральний центр

Тема 4. Бактерії. Гриби. Лишайники. Частина А. 1. Наявність в складі лишайника ціанобактерій забезпечує 1) поглинання атмосферної та ґрунтової вологи 2) використання світла для утворення поживних речовин

БІОЛОГІЯ НАУКА про живу природу Біологія вивчає: ЩО ВИВЧАЄ БИОЛОГИЯ z будова і життєдіяльність живих організмів; z закони індивідуального і історичного розвитку організмів. 3 СИСТЕМА органічного

1. Нитрифицирующие бактерії відносять до 1) хемотрофов 2) фототрофам 3) сапротрофами 4) гетеротрофам ТЕМА «Фотосинтез» 2. Енергія сонячного світла перетворюється в хімічну енергію в клітинах 1) фототрофов

МІКРОБІОЛОГІЯ І ГЕНЕТИКА Завдання 1. Приготувати і проаналізувати препарати з двох відомих кисломолочних продуктів. (Мах.10 балів) Устаткування: Мікроскопи, пальники або спиртівки, предметні скельця,

Кваліфікаційні тести за спеціальністю «Бактеріологія» Банк тестових завдань для підготовки до атестації Вибрати один або кілька правильних відповідей 1. Відповідно до наказу ГКСЕН РФ N обов'язкова

Завдання 3. Одноклітинні і багатоклітинні організми. Царство гриби 1. Що міститься в чорних кульках на кінцях довгих відгалужень у гриба мукора? 1) мікроскопічні плоди 2) поживні речовини 3)

ДЕРЖАВНА БЮДЖЕТНА освітні установи ВИЩОЇ ОСВІТИ «Оренбурзька ДЕРЖАВНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ» Методичні рекомендації для самостійної роботи навчаються

Морфологія мікроорганізмів Варіант 1 1. Gracilicutes - це: А. тонкостеночние бактерії Б. толстостеночние бактерії В. бактерії з дефктной клітинною стінкою. Г. бактерії з ніжною клітинною стінкою. 2. До

Завдання для студентів: необхідно вибрати правильні відповіді (може бути від одного до декількох). Морфологія мікроорганізмів Варіант 1 1. Gracilicutes - це: А. тонкостеночние бактерії Б. толстостеночние

Водорості Водорості нижчі рослини Водорості велика і неоднорідна група нижчих рослин. Водорості найчисленніші і одні з найважливіших для планети фотосинтезуючих організмів. Вони зустрічаються

Муніципальне бюджетне загальноосвітній заклад Аларская середня загальноосвітня школа «Розглянуто» Керівник МО Протокол від 0 р «Погоджено» Заступник директора з НВР МБОУ 0 г «Стверджую»

1 Основні прийоми роботи з мікроорганізмами Завдання 1. Введення в мікробіологію.техніка безпеки при роботі з мікроорганізмами Мета завдання. Це завдання познайомить вас з правилами безпечної роботи в

Завдання 2. Клітинна будова організмів 1. Який хімічний елемент входить до складу життєво важливих органічних сполук клітини? 1) фтор 2) вуглець 3) мідь 4) калій 2. Як запасаючих речовини

Пліснява вплив фізичних факторів на ріст і розвиток грибів. Логунов Степан 7г Керівник проекту Буличова М.Б. Актуальність дослідження Спори грибів відрізняються високою стійкістю до несприятливих

Тест 5 Варіант 1. Тема «Гриби» Завдання з вибором однієї правильної відповіді. 1. Головна відмінність грибів від рослин полягає в тому, що вони: мають клітинну будову, поглинають з ґрунту воду і мінеральні солі,

1. Пояснювальна записка Програма призначена для вступників до аспірантури ФГБОУ ВПО БГУ за фахом 03.02.03 - Мікробіологія Програма підготовки висококваліфікованих фахівців у напрямку

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ

Карачаєво-Черкеська ДЕРЖАВНА ТЕХНОЛОГІЧНА АКАДЕМІЯ

Кафедра технології виробництва продуктів тваринництва

МІКРОБІОЛОГІЯ

МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ

до лабораторних і практичних занять студентам

аграрного інституту

Черкеськ - 2010

Складено на основі зразкової і робочої програм по курсу «Мікробіологія» відповідно до Державного освітнім стандартом вищої професійної освіти за спеціальністю 110305 «Технологія виробництва і переробки сільськогосподарської продукції» та 110201 «Агрономія» (2000 р).

Обговорено на засіданні кафедри ТППЖ (протокол від 2.07.2009 р)

Затверджено методичною комісією Аграрного інституту (протокол №6 від 01.01.2001 р). Опубліковані за рішенням навчально-методичної ради Карачаєво-Черкеської державної технологічної академії (протокол від 01.01.2001р.)

укладачі:кандидат біологічних наук, доцент , кандидат сільськогосподарських наук, доцент , асистент

рецензенти: – кандидат біологічних наук

доцент кафедри «Агрономія»

доцент кафедри «ТППЖ»

Редактор: к. С.-г. наук, доцент
зміст

Введение ................................................................................. .. 6

1. Мікроскопія ........................................................................ .. 7

1.1.Светопольная мікроскопія .................................................... .7

1.1.1. Пристрій мікроскопа ...................................................... 7

2. Робота з мікроорганізмами ....................................................... 8

2.1.Методи приготування препаратів ....................................... ..... 8

2.1.1.Техніка взяття культури для препаратів ................................. 8

2.1.2. Дослідження живих клітин мікроорганізмів методом роз-

тиск краплі ............................................................... .. 8

2.1.3. Фіксовані препарати мікроорганізмів ........................... 9

Освітлювальна система знаходиться під предметним столиком. Дзеркало відображає падаюче на нього світло в конденсор. Одна сторона дзеркала плоска, інша - увігнута. При роботі з конденсором необхідно користуватися плоским дзеркалом. Увігнуте дзеркало застосовують при роботі без конденсора з об'єктивами малих збільшень. Конденсор складається з 2-3 короткофокусних лінз, збирає промені, що йдуть від дзеркала і направляє їх на об'єкт. Конденсор необхідний при роботі з імерсійними системами. У конденсорі є ірисова (кулькова) діафрагма, що складається зі сталевих серповидних пластинок.

Пофарбовані препарати розглядають при майже повністю відкритій діафрагмі, нефарбовані - при зменшеному отворі діафрагми.

об'єктив - багатолінзові система, від якості якої залежить зображення об'єкта. Зовнішня лінза називається фронтальною, вона забезпечує збільшення. Решта лінзи виконують функції корекції оптичних недоліків.

Об'єктиви бувають сухі і занурені (імерсійним). При роботі з сухими об'єктивами між фронтальною лінзою об'єктива і об'єктом дослідження знаходиться повітря. При роботі з іммерсійним об'єктивом V \u003d 90х між покривним склом і лінзами об'єктива знаходиться кедрова олія, показник заломлення якого близький до показника заломлення скла 1,515 і 1,52 відповідно. Об'єктиви мають збільшення 8х, 40х і 90х.

окуляр служить безпосереднім продовженням «лінз» (кришталиків) очей людини.

Окуляр складається з двох лінз - верхньої - очної і нижньої - збиральної, укладених в металеву оправу. Призначення окуляра - збільшення зображення, яке дає об'єктив. Збільшення окуляра викарбувано на його оправі. Робоча збільшення окулярів в межах від 4-х до 15х.

окуляри бувають різних типів, І вибір залежить від об'єктива. При тривалій роботі з мікроскопом користуються бинокулярной насадкою, так як вона покращує видимість об'єкта, знижує яскравість зображення і тим самим зберігає зір.

Робота з мікроорганізмами

2.1. Методи приготування препаратів

2.1.1. Техніка взяття культури для препаратів

Обпаленої в полум'ї бактеріологічної голкою з пробірки беруть невелику кількість мікробної маси. Якщо культура рідка, то краще для цього користуватися петлею, в інших випадках - голкою.

2.1.2. Дослідження живих клітин мікроорганізмів методом роздавленої краплі

Досліджують живі клітини мікроорганізмів методом роздавленої краплі, попередньо проводять фарбування об'єкта прижиттєвими фарбниками - вітальна забарвлення(Барвники: метиленовий синій, нейтральний червоний в концентраціях від 0,001 до 0,0001%).

Препарати микроскопируют, злегка затемнюючи поле зору; конденсор трохи опускають, надходження світла регулюють увігнутим дзеркалом. Спочатку користуються малим збільшенням - об'єктив 8х, після того як виявляють край краплі, встановлюють об'єктив 40х або іммерсійний (90х).

У разі використання методу роздавленої краплі на чисте предметне скло наносять краплю водопровідної води. У неї вносять культуру і змішують з водою. Надлишок води видаляють фільтрувальної папером. При використанні иммерсионного об'єктива на предметне скло наносять краплю кедрової олії і проводять мікроскопію.

2.1.3. Фіксовані препарати мікроорганізмів

Фіксовані препарати припускають таку обробку живих клітин, яка дає можливість швидко перервати перебіг життєвих процесів в об'єкті, зберігши його тонку структуру. В результаті фіксації клітини міцно прикріплюються до скла і краще фарбуються. Фіксація необхідна в разі роботи з патогенними мікроорганізмами (в цілях безпеки).

Приготування мазка. На чисте знежирене предметне скло наносять краплю водопровідної води. Для знежирення стекол використовують суміш етилового спирту і сірчаного ефіру в співвідношенні 1: 1. Прокаленной бактеріологічної голкою з пробірки з культурою беруть невелику кількість мікробної маси і вносять в краплю води. Краплю ретельно розмазують петлею по склу на площі близько 4 см2.

Якщо суспензія густа, її спочатку розводять водою. Для цього прокаленной петлею беруть трохи суспензії і переносять в краплю води на інше предметне скло. Суспензію нормальної густоти розмазують тонким шаром по склу, потім мазок сушать на повітрі при кімнатній температурі або при слабкому нагріванні, тримаючи препарат високо над полум'ям пальника. Сильне нагрівання препарату при сушінні не рекомендується для уникнення коагуляції білків, що спотворює структуру і форму клітин. Висушений препарат фіксують.

Фіксація мазка. її проводять над полум'ям пальникаабо за допомогою хімічних зієднань. У першому випадку препарат три-чотири рази повільно проводять нижньою стороною над полум'ям пальника, в другому випадку використовують хромові сполуки: формалін, осмієва кислоту, ацетон. Один з найпоширеніших прийомів фіксації - обробка препарату 96% -ним спиртом або сумішшю рівних обсягів етилового спирту і ефіру (рідина Никифорова). Для цього препарати занурюють на 10-30 хв у фіксуючу рідину.

Фарбування препарату. На мазок наносять кілька крапель барвника. Залежно від виду барвника і цілі дослідження тривалість фарбування варіює від 1 до 5 хв, в окремих випадках займаючи до 30 хв. Після закінчення фарбування препарат промивають водою, фільтрувальним папером видаляють воду, підсушують на повітрі і проводять мікроскопію.

Існують прості і диференційовані методи забарвлення.

при простий забарвленням використовують будь-якої один барвник (метиленовий синій, фуксин, генціан фіолетовий), фарбується вся клітина.

при диференційованої забарвленням окремі структури клітини фарбуються різними барвниками (забарвлення по Граму, забарвлення суперечка).

Дослідження морфології мікроорганізмів

3.1. форма клітин

3.1.1. бактерії

За формою все бактерії ділять на кулясті (коки), паличкоподібні і покручені.

Кулясті бактерії - коки.

1. мікрококи -поодинокі кулясті клітини ( Micrococcus agilis).

2. диплококи -кулясті коки, з'єднані по двоє. ( Azotobacter chroococcum).

3. тетракоккі- кулясті коки, з'єднані по чотири.

4.стрептококи- кулясті бактерії, з'єднані в ланцюжки (в основному відносяться патогенні, а також молочнокислі бактерії Lactococcus lactis).

5. сарціни - кулясті бактерії, що групуються по 8 клітин, виникають в результаті поділу клітини в трьох взаємно перпендикулярних площинах. Деякі види сарцин формують великі кубообразние пакети, в яких з кожного боку знаходиться по 4 сарціни. типовий представник Sarcina flava (Сарцин жовта) - найбільш поширений представник мікрофлори повітря.

Всі кулясті форми бактерій, за винятком Streptoctococcus lactis, переглядають на фіксованих і забарвлених фуксином препаратах.

Паличкоподібні бактерії. До них відносять форми не утворюють спори (пологи Pseudomonas, Achromobacter, Lactobacillus і ін.) і утворюють спори (пологи Bacillus, Clostridium та ін.).

неспорообразующие паличка Pseudomonas stutzeri – цитоплазма її фарбується рівномірно.

спороутворюючі палички Bacillus mycoidesі Bacillus mesentericus.Під мікроскопом виглядають нерівномірно забарвленими. Суперечки не фарбуються, як більш щільні структури. клітини Bacillus mycoides розташовуються ланцюжками, це стрептобацили.

Паличкоподібні бактерії переглядають на фіксованих і забарвлених препаратах.

покручені форми

1. Вібріони – злегка зігнуті клітини.

2. Спірілли можуть мати один завиток у вигляді російської літери С, два завитка у вигляді латинської букви S або кілька - у вигляді спіралі.

3. Спірохети - довгі і тонкі клітини з великою кількістю завитків; довжина клітин перевищує їх товщину в 5-200 разів.

Вібріони і спірили зручно переглядати на фіксованому та пофарбованому препараті, приготованому з гною, попередньо інкубували протягом декількох діб в термостаті. З безлічі мікроорганізмів на такому препараті часто зустрічаються покручені форми.

З спірохетами можна познайомитися на фіксованому пофарбованому препараті зубного нальоту, особливо вдалі препарати зіскрібка з каріесних зуба. Зубні спірохети дуже тонкі, волосоподібні, короткі (всього 2-3 завитка).

3.1.2. актиноміцети

Актиноміцети - променисті гриби. Міцелій актиноміцетів на поживних середовищах диференційований: одна частина його занурена в субстрат (субстратної міцелій), інша перебуває над субстратом (повітряний міцелій).

Багато представників актиноміцетів продукують пігменти, тому їх повітряний міцелій і особливо колонії забарвлені в блакитний, синій, фіолетовий, рожевий, бурий, коричневий або чорний кольори. Актиноміцети забарвлюють живильне середовище у відповідні кольори.

На предметне скло наносять шматочок колонії актиномицета разом із середовищем. Другим предметним склом щільно притискають цей шматочок до скла, розчавлюють і розмазують по склу. Препарат сушать, фіксують, фарбують, дивляться під мікроскопом, де частково проглядаються міцеліальні одноклітинні нитки.

3.1.3. дріжджі

Дріжджі - одноклітинні мікроскопічні гриби різноманітні за формою: еліпсовою, грушоподібна, округла, циліндрична. Розмножуються вегетативним і статевим шляхом.

Для лабораторних занять використовують пекарські дріжджі. Невеликий шматочок дріжджової маси за кілька годин до занять поміщають в теплу підцукровані воду і ставлять в тепле місце. Утворюється білувата каламутна рідина. Краплю цієї рідини наносять на предметне скло, накривають покривним склом, зверху наносять краплю кедрової олії і переглядають препарат з иммерсионной системою. Видно почкующиеся і діляться клітини.

3.2. Хімічні методи дослідження

3.2.1. Забарвлення клітин мікроорганізмів по Граму

Цей метод диференціації мікробних клітин заснований на відмінності в хімічний склад клітинних оболонок. У клітинах одних видів мікроорганізмів утворюється нерозчинний в спирті з'єднання йоду з основним барвником, а у інших видів це з'єднання з'являється тимчасово і після обробки спиртом розчиняється. Мікроорганізмів першої групи називають грампозитивними другий - грамнегативними.

Техніка забарвлення за Грамом. На знежирене предметне скло наносять три тонких мазка різних культур мікроорганізмів (два з них - контрольні, з заздалегідь відомим ставленням до фарбування за Грамом). Мазки висушують на повітрі, фіксують над полум'ям пальника і забарвлюють протягом 1 хв фенольні розчином генціан фіолетового (або кристалічного фіолетового), тримаючи скло в злегка похилому положенні. Потім барвник зливають і, не промиваючи препарат водою, наносять на нього на 1 хв розчин Люголя (до повного почорніння мазка). Скло тримають в похилому положенні. Препарат, що не промиваючи водою, обробляють, безперервно похитуючи, 96% -ним спиртом протягом 15-20 с. Важливо дотримуватися часу знебарвлення, так як при перевищенні зазначеного терміну знебарвлюються і грампозитивні клітини.

Промивши водою, препарат фарбують фуксином Пфейфера протягом 1 хв. Грампозитивнімікроорганізми набувають темно-фіолетовий колір, а грамнегативні фарбуються в колір додаткової забарвлення (фуксину).

Результати забарвлення по Граму залежать від віку культури: в старих культурах мертві клітини завжди фарбуються грамнегативних. Тому краще використовувати молоді однодобового культури.

Добрими об'єктами для забарвлення клітин мікроорганізмів по Граму служать дріжджі, Bacillus mesentericus або Bacillus subtilis (Грампозитивні) і кишкова паличка Escherichia coli (грамотрицательная).

Барвники і реактиви для забарвлення по Граму.

1. Феноловий розчин генціан фіолетового:генціан фіолетовий - 1 г, спирт 96% -ний - 10 мл, фенол кристалічний - 2 г, вода дистильована - 100 мл.

У деяких випадках застосовують спиртовий розчин генціанфіолетового:генціан фіолетовий (або кристалічний фіолетовий) - 1 г, спирт 96% -ний (ректифікат) - 100 мл, гліцерин - 5 мл. Суміш ставлять в термостат на 24 год, потім фільтрують.

2. розчин Люголя(Іодіт калію - 2 г, йод кристалічний - 1 г, вода дистильована - 300 мл). Спочатку готують концентрований розчин іодіта калію в 5 мл води, в ньому розчиняють йод, потім додають воду до 300 мл.

3. спирт96% -ний.

4. фуксин Пфейфера(Водний розчин карболового фуксину Циля): 1 мл карболового фуксину Циля і 9 мл дистильованої води. Готують його так: 1 г фуксину, 5 г фенолу кристалічного, 96% спирт - 10 мл, кілька крапель гліцерину, 100 мл дистильованої води, фуксин розчиняють в етанолі, додають розчинений у воді фенол. Розчин перемішують і залишають на кілька днів. Перед використанням його фільтрують.

3.2.2. Забарвлення суперечка у бактерій

Спори бактерій в порівнянні з вегетативними клітинами мають високу стійкість до несприятливих умов зовнішнього середовища. Вони являють собою округлі, овальні або елліпсовідниє освіти. Якщо діаметр суперечки не перевищує діаметра клітини, в якій спора утворюється, клітку називають бацилярних, якщо перевищує, то в залежності від розташування суперечки в центрі або на кінці клітини цю клітку називають відповідно клостридиальной або плектрідіальной . У бацилярних клітці спору може розміщуватися в центрі клітини - центральнестановище, на кінці - термінальнеі ближче до одного з кінців - субтермінальностановище.

При спостереженні за живими спороутворюючими бактеріями їх суперечки можна розрізнити по сильнішого заломлення світлових променів. Спори кислотостійких, тому з працею фарбуються барвниками. Пояснюється це великою щільністю оболонки, низькою концентрацією в ній вільної води і високим вмістом ліпідів в суперечках. У препаратах, забарвлених простими способами або по Граму, суперечки залишаються безбарвними (Негативне забарвлення).

Всі способи забарвлення суперечка засновані на єдиному принципі: Спочатку суперечки протруюють різними речовинами: хромової, соляної, сірчаної, оцтової кислоти, аміаком, їдким натром або перекисом водню, потім фарбують клітку зі спору при нагріванні і, нарешті, знебарвлюють цитоплазму і додатково забарвлюють її контрастним барвником.

Метод Ціля-Нільсена в модифікації Мюллера.До фіксації мазка бактерій на полум'я препарат готують звичайним способом. Далі на фіксований в полум'я і остиглий препарат наносять 5% -ний розчин хромової кислоти. Через 5-10 хв її змивають водою. Препарат накривають смужкою фільтрувального паперу і рясно змочують папір карболовим фуксином Циля. Підігрівають препарат над полум'ям до появи парів (не до кипіння), потім відводять його в бік і додають нову порцію барвника. Цю процедуру проводять протягом 7 хв. Важливо, щоб барвник випаровувався, але папір не підсихали. Після охолодження її знімають, препарат промивають водою і ретельно промокають фільтрувальної папером. В результаті такої обробки клітини зі спорами рівномірно фарбуються.

Далі обесцвечивают цитоплазму клітин (але не суперечки), обробляючи 1% -ним розчином соляної або сірчаної кислот протягом 15-30 с. При приготуванні препарату суперечка Bacillus mycoides або Bacillus mesentericus рекомендується знебарвлювати цитоплазму 16-18 с (розмірено вважаючи вголос від 21 до 37-40). При перевищенні цього часу можуть втратити колір і суперечки. Потім препарат промивають водою і забарвлюють метиленовим синім 2 хв.

Забарвлення виходить контрастною і яскраво-червоні суперечки чітко виділяються на блакитному тлі цитоплазми.

Метод Пєшкова. На фіксований в полум'я препарат наливають метиленовийсиній Леффлера, доводять його до кипіння і кип'ятять 15-20 с, тримаючи скло над полум'ям. Мазок промивають водою і дофарбовують протягом 30 з 0,5% -ним водним розчином нейтрального червоного. Ще раз промивають, підсушують і далі досліджують препарат з масляною иммерсией об'єктива. Спори фарбуються в блакитний або синій кольори, цитоплазма - в рожевий.

Для дослідження суперечка зручними об'єктами можуть служити Bacillus mesentericus або Bacillus mycoides у віці 4 діб.

Реактиви для фарбування спор бактерій.1. карболовий фуксинЦиля(Див. 3.2.1).

2. Метиленовийсиній Леффлера(Див. 3. 2. .1).

3. Насичений водний розчин метиленового синього.2 г барвника і 100 мл дистильованої води.

4. Хромова кислота,5% -ний розчин.

5. соляна(або сірчана кислота,1% -ний розчин.

4. Культивування мікроорганізмів

4.1. живильні середовища

4.1.1. Приготування поживних середовищ

М'ясо-пептони бульйон (МПБ).Для приготування м'ясо-пептони середовищ використовують м'ясний бульон,який одержують у такий спосіб: 500 г дрібно порубаного свіжого м'яса заливають в емальованій каструлі 1 л водопровідної води, нагрітої до 50 ° С, і залишають настоюватися 12 год при кімнатній температурі або 1 ч при 50-55 ° С. М'ясо віджимають, екстракт проціджують через марлю із шаром вати, кип'ятять 30 хв для згортання колоїдних білків і фільтрують двічі (перший раз через марлю з ватою, другий - через паперовий фільтр). Фільтрат доливають водою до 1 л, розливають в колби, закривають ватними пробками і стерилізують при 120 ° С 20 хв (пробки колб закривають зверху ковпачками з паперу).

М'ясний бульйон може бути використаний в будь-який час для приготування середовищ. Якщо їх готують відразу, то попередня стерилізація м'ясного бульйону не потрібно.

Для приготування МПБ до 1 л м'ясного бульйону додають 5-10 г пептона(Перший продукт гідролізу білка) для підвищення калорійності середовища та 5 г кухонної солідля створення осмотичної активності. Середу нагрівають до розчинення пептона, постійно помішуючи.

Встановлюють нейтральну або слаболужну реакцію середовища, припливу 20% -ний розчин Na2C03 до посиніння вологою червоною лакмусового папірця. Для перевірки рН середовища зручно використовувати індикатор бромтимолблау:1-2 краплі його змішують у фарфоровій чашці з краплею бульйону. У нейтральному середовищі бромтимолблау - темно-зелений, у кислому - жовтий, в лужному - синій.

Після встановлення рН середу знову кип'ятять 5-10 хв, і білки, що згорнулися при зміні реакції середовища, фільтрують через паперовий фільтр без освітлення бульйону або освітливши його білком. Для цього свіжий яєчний білок збивають з подвійним за обсягом кількістю води і змішують з охолодженим до 50 ° С бульйоном. Суміш кип'ятять, помішуючи, на слабкому вогні 10 хв, потім фільтрують. Прозорий м'ясо-пептони бульйон розливають в пробірки, закривають ватяними пробками і стерилізують при 120 ° С 20 хв.

М'ясо-пептони агар (МПА).До 1 л МПБ додають 15-20 г агару. Середу нагрівають до розчинення агару (температура його плавлення - 100 ° С, затвердіння - 40 ° С), встановлюють слаболужну реакцію середовища 20% -ним розчином Na2C03 і через лійку розливають в пробірки (приблизно по 10 мл агару стовпчиком для подальшого розливу по чашках Петрі і по 5 мл для отримання скошеного агару - косяків).

При розливі агару краю пробірок повинні залишатися сухими, інакше пробки прилипнуть до скла. Пробірки із середовищем стерилізують в автоклаві при 120 ° С 20 хв.

4.2. методи стерилізації

стерилізація - це повне знищення клітин мікроорганізмів в поживних середовищах, посуді тощо.

Відомо кілька методів стерилізації. Найчастіше застосовують стерилізацію нагріванням.

4.2.1. Фламбірованія, або прожарювання

Прожарювати можна безпосередньо перед вживанням платинові петлі, голки, шпателі, дрібні металеві предмети (ножиці, ланцети, пінцети), а також скляні палички, предметні, покривні скла і т. Д.

4.2.2. Стерилізація сухим жаром

Її застосовують для обробки посуду і сухих матеріалів, наприклад крохмалю, крейди. При цьому стерилізується об'єкт витримують при 170 ° С протягом 2 год (з моменту, встановлення необхідної температури) в електросушильні шафах. Піднімати температуру вище 170 ° С не рекомендується: ватні пробки і папір починають руйнуватися.

Перед стерилізацією скляний посуд закривають ватяними пробками і обгортають папером. Чашки, пробірки, піпетки, вату, марлю загортають у папір або поміщають в особливі футляри та пенали, в яких стерильна посуд може зберігатися після стерилізації.

Після закінчення стерилізації шафа відкривають тільки після того, як температура знизиться до кімнатної, інакше скло може лопнути.

4.2.3. Стерилізація текучим паром

Текучою парою (100 ° С) обробляють предмети, що псуються від сухого спека, і деякі поживні середовища, які не витримують більш високої температури (середовища з вуглеводами, МТЖ, молоко). Проводять стерилізацію в кип'ятильник Коха по 30 хв протягом 3 діб щодня. Така стерилізація називається дробової.

При одноразовому прогріванні при температурі 100 ° С протягом 30 хв гинуть вегетативні клітини, спори ж багатьох мікроорганізмів залишаються життєздатними. Після такого прогріву середу поміщають на 24 ч в термостат при 28-30 ° С. Спори, що збереглися при першому нагріванні, встигають, за цей час прорости в вегетативні форми, які гинуть при подальшому нагріванні. Потім цю операцію повторюють ще 2 рази.

4.2.4. Стерилізація насиченою парою під тиском

Це найбільш швидкий і надійний спосіб стерилізації, при якому гинуть самі стійкі спори. З його допомогою стерилізують більшість поживних середовищ, посуд.

Обробку насиченою парою проводять в герметично закривається товстостінній казані - автоклаві.На кришці або збоку автоклава знаходяться кран для виходу пара, манометр і запобіжний клапан. Манометр показує, на скільки тиск пара всередині котла вище нормального. Для запобігання вибуху при перевищенні граничного тиску спрацьовує запобіжний клапан, даючи вихід пару.

Показником манометра в фізичних атмосферах відповідає певна температура.

Надійної стерилізації досягають нагріванням при 120 ° С і тиску 1 атм протягом 20 хв.

Стерилізацію ведуть у такий спосіб. Наливають воду в автоклав, поміщають в нього стерилізується предмети, загвинчують кришку автоклава і починають підігрів. Кран залишають відкритим до тих пір, поки все повітря, що знаходиться в автоклаві, що не буде витіснений парами води. Коли пара почне виходити з крана оддихаючи, кран закривають, доводять тиск пари в автоклаві до 1 атм і підтримують на цьому рівні 20-30 хв. Потім нагрів припиняють, чекають, поки стрілка манометра опуститься до 0, обережно (потроху) відкривають кран і спускають пар. Тільки потім відгвинчують кришку автоклава. Якщо кран відкрити раніше, ніж впаде тиск, то рідина в стерилізуємих судинах закипить і виштовхне з них пробки.

Автоклав використовують і для дробової стерилізації текучим паром. В цьому випадку кришку не загвинчують, щоб забезпечити вільний вихід пару.

4.2.5. пастеризація

Пастеризація є неповну, або часткову, стерилізацію, що означає нагрівання при 65-80 ° С протягом відповідно 30-10 хв з наступним швидким охолодженням до 10-11 ° С. Пастеризують молоко, пиво, вино і інші продукти.

Матеріали та обладнання

МПБ, агар, лакмус червоний, бромтимолблау, порцелянові пластинки з лунками або чашки, скляні палички, 20% -ний розчин Na2C03, пробірки в штативах (для розливання агару), воронки, вата, чашки Петрі, піпетки Мора на 1 мл, папір для обгортання чашок і піпеток, колби ємністю 250 мл, суворі нитки.

5. Облік чисельності та виділення чистої культури мікроорганізмів

5.1. Методи обліку чисельності мікроорганізмів

5.1.1. Облік чисельності мікроорганізмів (КУО) в грунті методом поживних пластин в поєднанні з методом послідовних розведень

Грунт - найбільш сприятливе середовище для розвитку мікроорганізмів. У зв'язку з великою гетерогенністю її складу для обліку чисельності в ній мікроорганізмів з досліджуваної ділянки беруть середнюгрунтову пробу.

Спочатку готують суспензії (методом розведення), що містять різні концентрації грунту в 1 мл води. Для цього на стерильне годинне скло стерильним порцеляновим шпателем або алюмінієвої чайною ложкою беруть з банки або мішка навішення грунту в 1 м Годинний скло, шпатель, ложку Фламбе-ють в полум'я пальника або, змочивши в спирті, обпалюють. При зважуванні грунту годинне скло накривають іншим стерильним годинниковим склом.

Наважку грунту, дотримуючись умов асептики, переносять в колбу на 250 мл з 99 мл стерильної води. Суміш збовтують 5 хв, не змочуючи пробку. Стерильною піпеткою беруть 1 мл суспензії, що містить 10-2 г грунту, і переносять в пробірку з 9 мл стерильної водопровідної води. Піпетку неодноразово промивають водою в пробірці, щоб максимально змити клітини з її стінок. Інший стерильною піпеткою беруть з колби ще 1 мл суспензії і поміщають в другу колбу, також містить 99 мл стерильної водопровідної води. Цю піпетку промивають таким же чином, як і в першому випадку. Пробірку і другу колбу збовтують 1 хв. Концентрація грунту в пробірці буде 10-3 г, у другій колбі -10-4 м Точно так же новими стерильними піпетками переносять по 1 мл суспензії з другої колби в другу пробірку з 9 мл і в третю колбу з 99 мл стерильної водопровідної води і готують нові суспензії, що містять в 1 мл відповідно 10-5 і 10-6 г грунту.

ПРАКТИЧНІ РОБОТИ

Для студентів другого курсу

ПО МІКРОБІОЛОГІЇ

1. Мікробіологічна лабораторія.

2. Мікроскопічні методи дослідження. Знайомство з мікроскопом.

3. Методи фарбування препаратів. Способи приготування препаратів

для мікроскопії.

4. Способи збору матеріалу. Живильні середовища.

5. Бактеріологічний метод дослідження на прикладі стафілококів.

6. Культивування і індикація вірусів.

9. Вплив факторів зовнішнього середовища на мікроорганізми.

10. Серологічні реакції. Реакція аглютинації.

11. Реакція гемаглютинації.

12. Реакція зв'язування комплементу.

13. Реакція преципітації. Реакція кольцепреціпітаціі.

14. Реакція імунофлюоресценції. Реакція імунітету (шкірні проби).

Опсонофагоцітарная реакція.

15. Вакцини.

16. Сироваткові препарати.

Вступ

Методичний посібник розроблено в допомогу студентам московського медичного коледжу залізничного транспорту МІІТа для підготовки практичних робіт в рамках дисципліни «Основи мікробіології, вірусології та імунології».

навчальний модуль

Тема занять: см.содержаніе

Тип занять: практичне

Місце проведення заняття: лабораторія мікробіології

Час: 16 * 2. години

Студент повинен знати:

РОЗДІЛ 1

ОСНОВИ МЕДИЧНОЇ

Бактеріолог і МІКРОБІОЛОГІЇ

ПРАКТИЧНА РОБОТА № 1

Тема: «Мікробіологічна лабораторія»

Мікробіологічна лабораторія організовується при лікарнях і санітарно-епідеміологічних станціях. Існують також спеціальні лабораторії, в яких працюють зі збудниками особливо небезпечних інфекцій, це

вірусологічні лабораторії та ін.

До завдань мікробіологічної лабораторії входить:

1) бактеріологічна діагностика інфекційних захворювань;

2) санітарно-бактеріологічні дослідження води, повітря та об'єктів

довкілля;

До складу лабораторії входить:

1) лабораторна кімната з заскленим боксом для проведення

мікробіологічних досліджень (в боксі повинна бути встановлена

бактерицидна лампа);

2) мийна;

3) препараторська (приміщення для підготовки посуду і інших

допоміжних робіт);

4) автоклавна;

5) приміщення для прийому аналізів і видачі результатів досліджень;

6) віварій;

Мікробіологічна лабораторія повинна бути оснащена:

• термостатом,
• холодильником,
• сушильними камерами,
• центрифугою,
• лабораторним посудом;

А також обладнанням:

• спиртової або газовим пальником
• бактеріологічними петлями
• дез. розчином