Praktická práce v mikrobiologii. Workshop o mikrobiologii

Federální agentura pro vzdělávání

Státní vzdělávací instituce

Irkutsk Státní univerzita»

MALÁ PRAXE V MIKROBIOLOGII

Studijní průvodce

Irkutsk 2009

UDC 579 (076,5)

Publikováno rozhodnutím Redakční a publikační rady Irkutské státní univerzity

Zhilkinův workshop o mikrobiologii: učebnicová metoda. manuál pro stud. vyšší. studie. instituce ve specializacích „Mikrobiologie“, „Biologie“ a „Fyziologie“.

6. Mikrobiální hmota by neměla kontaminovat ruce, stůl a okolní předměty. Rozlitá mikrobiální suspenze se neutralizuje pomocí dezinfekčních prostředků.

7. Po skončení práce jsou kultury předány učiteli, naočkované zkumavky a kelímky jsou umístěny do termostatu.

8. Bakteriologické kličky, jehly, pinzety a další kovové předměty jsou po kontaktu s mikroorganismy spáleny v plameni alkoholové lampy a umístěny do speciálního stojanu.

9. Použitá sklíčka a krycí sklíčka, pipety, špachtle atd. Se umístí do 3–5% roztoku kyseliny karbolové nebo jiných dezinfekčních roztoků.

10. Spotřebované kultury ve zkumavkách, Petriho miskách atd. Se neutralizují po dobu 24 hodin dezinfekčními roztoky, poté se misky povaří a umyjí.

11. Je třeba přísně dodržovat osobní hygienu - po dokončení práce si ruce důkladně omyjte mýdlem a vodou.

12. Při práci s elektrickými spotřebiči a chemickými činidly je nutné dodržovat bezpečnostní opatření.

OBECNÁ MIKROBIOLOGIE
Kapitola I. Mikroskop a mikroskopická technika
1. Světelně-optická mikroskopie
2. Mikroskopie tmavého pole
3. Mikroskopie s fázovým kontrastem
4. Luminiscenční (fluorescenční) mikroskopie
Kapitola II. Obecná znalost pěstování, osevní techniky a nezbytného vybavení pro práci s mikroorganismy
Kapitola III. Metody přípravy přípravků z mikroorganismů
Kapitola IV. Výzkum mikrobiálních buněk
1. Formy buněk mikroorganismů
2. Struktura buněk mikroorganismů (metody cytochemického výzkumu)
3. Gramové barvení buněk mikroorganismů
4. Zbarvení spór v bakteriích
5. Barvení kapslí
6. Zbarvení bičíků
7. Zbarvení jaderné látky bakterií
8. Barvení inkluzí buněk mikroorganismů
Kapitola V. Výživa mikroorganismů
1. Význam jednotlivých živin
2. Příprava kultivačních médií
3. Metody sterilizace
Kapitola VI. Počítání počtu bakterií a izolace čisté kultury
1. Počítání počtu bakterií v půdě
2. Stanovení kvalitativního složení bakterií
3. Počítání počtu mikroorganismů ve vodě a jiných kapalinách
4. Počítání počtu bakterií ve vzduchu
5. Izolace čistých kultur bakterií
Kapitola VII. Stanovení druhu bakterií
Kapitola VIII. Konverze organických látek bez dusíku mikroorganismy
Fermentační procesy
1. Alkoholické kvašení
2. Fermentace kyselinou mléčnou
3. Fermentace kyselinou máselnou
4. Fermentace pektinových látek
5. Fermentace celulózy
6. Oxidace vlákna
7. Oxidace tuku
8. Oxidace uhlovodíků
Kapitola IX. Konverze organických a minerálních sloučenin dusíku mikroorganismy
1. Ammonifikace
2. Nitrifikace
3. Denitrifikace (dýchání dusičnany)
4. Biologická fixace atmosférického dusíku
Kapitola X. Transformace sloučenin síry, železa a fosforu mikroorganismy
1. Konverze sloučenin síry mikroorganismy
2. Účast mikroorganismů na přeměně železa
3. Konverze sloučenin fosforu mikroorganismy
ZEMĚDĚLSKÁ MIKROBIOLOGIE
Kapitola XI. Obecná mikrobiologická analýza půdy
1. Metody výzkumu
2. Skupiny mikroorganismů, složení a příprava kultivačních médií
3. Odebrání průměrného vzorku půdy a jeho příprava na mikrobiologickou analýzu
4. Příprava suspenze půdy
5. Zvážení různých skupin mikroorganismů
6. Stanovení celkového počtu mikroorganismů v půdě přímým počítáním pod mikroskopem
Kapitola XII. Studium cenos mikroorganismů
1. Metoda zanášení skla podle N.G. Kholodnyho
2. Studium mikrobiálních cenóz v půdě metodou Perfilieva a Gabeho
3. Kapilární metoda Perfiliev upravená společností Aristovskaya
4. Identifikace mikroorganismů autochtonní skupiny účastnící se rozkladu huminových látek podle Vinogradského metody v Tepperově modifikaci
5. Identifikace mikroorganismů účastnících se rozkladu huminových látek Tepperovou metodou
Kapitola XIII. Stanovení biologické aktivity půdy
1. Stanovení biologické aktivity půdy intenzitou rozkladu plátna (metoda Mishustin, Vostrov a Petrova)
2. Stanovení obecné mikrobiologické aktivity půdy pro uvolňování oxidu uhličitého
3. Stanovení amonifikační aktivity půdy
4. Stanovení amonifikační aktivity mikroorganismů
5. Stanovení nitrifikační aktivity půdy
6. Stanovení denitrifikační aktivity půdy
7. Stanovení aktivity mikroorganismů fixující dusík
Kapitola XIV. Studium bakterií v kořenové zóně rostlin a na kořenech
1. Počítání bakterií v rhizosféře pomocí Krasilnikovovy metody
2. Posouzení rhizosféry a kořenové mikroflóry metodou postupného promývání kořenů podle E. 3. Tepper
3. Izolace čistých kultur nodulárních bakterií, kvantitativní účtování v půdě, stanovení jejich aktivity a virulence
Kapitola XV. Analýza bakteriálních preparátů
Kapitola XVI. Mikrobiologie krmiv
1. Epifytická mikroflóra zrna a její změna při skladování krmiva
2. Analýza sil
3. Krmivo z kvasnic
Kapitola XVII. Mikroflóra mléka a mléčných výrobků
1. Bakteriologická analýza mléka
2. Metody izolace bakterií mléčného kvašení v čisté kultuře
3. Seznámení s mikroflórou másla
Index literatury

Přepis

1 Ministerstvo školství a vědy Ruská Federace Federální agentura pro vzdělávání Moskevská státní univerzita environmentálního inženýrství N.A. Kustova LABORATORNÍ PRAXE V MIKROBIOLOGII Moskva 2005

2 Laboratorní workshop z mikrobiologie je určen pro studenty odborů 3207 a 3302 v oboru „Základy mikrobiologie a biotechnologie“, dále pro studenty Katedry environmentální a průmyslové biotechnologie v oboru „Environmentální a průmyslová mikrobiologie“. Workshop je rozdělen do tří sekcí. První část je věnována problematice obecné mikrobiologie. Práce této sekce studují morfologickou strukturu různých skupin mikroorganismů, metody mikroskopického vyšetření, techniku ​​mikrobiologického očkování, metody sterilizace a metody kvantitativního účtování mikroorganismů. Druhá část obsahuje práce o využití mikrobů v biotechnologiích k získávání různých látek organických kyselin, alkoholů, antibiotik, enzymů. V pracích třetí části jsou studovány otázky ekologické mikrobiologie. Některé práce ukazují úlohu mikroorganismů v globálních biogeochemických cyklech a zbytek je věnován problémům biotechnologické ochrany životního prostředí. Každé téma obsahuje teoretický úvod a praktickou část, která popisuje použité metody, postup při provádění práce, obsah zprávy o práci a také kontrolní otázky. 2

3 PŘEDMLUVA Laboratorní workshop z mikrobiologie je určen studentům 3. ročníku odborů 3207 a 3302 v oboru „Základy mikrobiologie a biotechnologie“, dále studentům 4. ročníku Katedry environmentální a průmyslové biotechnologie, obor „Biotechnologická ochrana životního prostředí „v oboru„ Environmentální a průmyslová mikrobiologie “. Laboratorní dílna vychází z „Metodických pokynů pro laboratorní práce“, vyd. PI Nikolaev, které byly použity na oddělení „Procesy a zařízení mikrobiologické výroby“ od vzniku oddělení. Při výuce mikrobiologie při výcviku techniků pro mikrobiologický průmysl významně přispěl vedoucí výzkumný pracovník, Ph.D. N.V. Pomortseva. Pod jejím vedením byly připraveny metodické pokyny akademici oddělení: M.A.Boruzdina, I.E. Lomova, N.A.Kustova, T.A.Makhotkina a K.A. Solovieva. Změna osnovy v souladu s novou specializací environmentální inženýr způsobil potřebu rozšířit kurz mikrobiologie a doplnit jej o úkoly týkající se biotechnologických metod ochrany životního prostředí. Laboratorní dílna je rozdělena do tří sekcí. První část je věnována obecné mikrobiologii: morfologii mikroorganismů, metodám jejího studia, technice mikrobiologických plodin, metodám kvantitativního účtování mikroorganismů. Druhá část obsahuje několik příkladů použití mikrobů v průmyslu. Třetí část se zabývá problematikou ekologie mikroorganismů, jejich rolí v globálních cyklech prvků a také v biotechnologických metodách ochrany životního prostředí. Na přípravě tohoto workshopu se podíleli postgraduální studenti oddělení N.V.Zyabreva a vedoucí vědecký pracovník. E.S. Gorshina. Autor vyjadřuje hlubokou vděčnost Doc. oddělení Mikrobiologie MSU N.N. Kolotilové za cenné připomínky a rady a také vedoucímu výzkumnému pracovníkovi. P. P. Makeevovi za pomoc při formátování textu a ilustračních materiálů. 3

4 4 OBECNÁ PRAVIDLA PRO PRÁCI V MIKROBIOLOGICKÉ LABORATOŘI Pravidla pro práci a chování v laboratoři Pravidla pro práci a chování v mikrobiologická laboratoř mají mnoho společného s pravidly práce v chemických laboratořích, ale mají svá specifika. Mikrobiolog ve většině případů pracuje s čistými kulturami mikroorganismů, tj. s mikroorganismy jakéhokoli rodu, druhu a kmene. Protože na všech okolních předmětech a ve vzduchu jsou cizí mikroby, používají se speciální metody práce, aby se zabránilo kontaminaci studované kultury mikroorganismu nebo samotné osoby. K tomu se sterilizují kultivační média, nádobí, nástroje, laboratoř a pracoviště se udržují v čistotě a při práci s mikroby se dodržují určitá pravidla. V laboratoři by neměly být žádné nepotřebné položky. Mokré čištění by mělo být prováděno pravidelně. Různé povrchy laboratorních místností jsou pravidelně dezinfikovány. Dezinfekce je dezinfekce, tj. ničení patogenů infekčních chorob na místech vnější prostředí... K tomu použijte 0,5 až 3% roztok chloraminu nebo 35% roztok fenolu (kyselina karbolová). Pracovní stůl by měl být dezinfikován 70% roztokem ethylalkoholu nebo isopropylalkoholu. Dezinfekce vzduchu se dosahuje jednoduchým větráním (alespoň min.). Účinnějším způsobem, jak dezinfikovat vzduch, je ozáření místnosti ultrafialovými paprsky pomocí germicídních lamp. Ke sterilizaci krabice se obzvláště často používá ultrafialové záření. Box je speciální malá místnost pro očkování čistých kultur, kvantitativní registraci mikroorganismů na Petriho miskách a některé další práce vyžadující zvláště čisté podmínky. Před prací je box ozářen min. Stůl se otírá alkoholem, stěny a podlaha se pravidelně myjí. Místo krabice mohou být laboratoře vybaveny skříněmi s laminárním prouděním (obr. 1), které jsou také sterilizovány baktericidními lampami. Na

Během provozu je zapnut ventilátor, který vytváří laminární proudění sterilního vzduchu procházejícího baktericidními filtry. Mezi hlavní vybavení mikrobiologické laboratoře patří: mikroskopy, termostaty pro pěstování mikroorganismů, sterilizační zařízení (autokláv a sušárna), centrifugy, destilátor, lednice pro skladování muzejních kultur mikroorganismů, skříně pro umístění skla a reagencií, potřebné nástroje (fotoelektrické kolorimetry, pH metry atd.). Každý student má přiděleno pracoviště, kam umístí: mikroskop zakrytý krytem, ​​bakteriologickou smyčku, podložní sklíčka a krycí sklenice, sterilní pipety, lihový hořák, proužky filtračního papíru, fix na skle, nádobu s dezinfekčním prostředkem . Na stole by nemělo být nic, co by přímo nesouviselo s výkonem práce. V laboratorních třídách mikrobiologie by měla být dodržována bezpečnostní pravidla. 5

6 6 Stručné informace o bezpečnosti v laboratoři V mikrobiologické praxi je široce používáno sklo vyrobené z chemického skla. Při práci s ním je třeba dávat pozor. Úlomky rozbitého nádobí opatrně odstraňte. Při analýzách se často používají silné roztoky zásad a kyselin. Musíte s nimi pracovat s velkou péčí, protože tyto látky jsou škodlivé pro pokožku rukou a oblečení. Pokud dojde k náhodnému rozlití kyseliny, měla by být pokryta velkým množstvím sody a poté několikrát opláchnuta vodou. Rozlitou zásadu je třeba důkladně setřít a předměty, na které se dostala, je třeba ošetřit slabým roztokem kyseliny octové. Pokud se kyseliny nebo zásady dostanou do styku s lidskou pokožkou, musí být okamžitě omyty velkým množstvím vody. Mikrobiologická laboratoř se zabývá živými mikroorganismy. Hlavní práce se provádí sterilně, tj. pracovat s jednou kulturou mikroorganismů, které by neměly být kontaminovány cizími mikroby. Aby se zabránilo kontaminaci plodin, používají se speciální metody sterilizace. Je také důležité udržovat laboratoř čistou. Kultury mikroorganismů obsahující nádobí by neměly být ponechány otevřené. Biomasa mikroorganismů, není -li pro analýzu potřebná, se vyhodí až po sterilizaci v autoklávu. Plodiny mikroorganismů se produkují v blízkosti plamene plynového nebo alkoholového hořáku, takže byste si měli dávat pozor na popáleniny a především opatrně sbírat dlouhé vlasy. Hořák by měl hořet pouze v případě potřeby. Pokud se během setí náhodně vznítí bavlněná zátka, alkoholová lampa nebo papír, uhaste oheň ručníkem. U větších požárů se používají hasicí přístroje. Použité pipety, sklíčka, krycí sklíčka, špachtle atd. umístit do nádoby s dezinfekčním roztokem. Studenti si musí neustále pamatovat, že mají co do činění s mikroorganismy, které nemusí být vždy bezpečné, zejména při práci na izolaci mikrobů od předmětů z prostředí. Na konci hodiny by proto měli studenti uklidit pracoviště a umýt si ruce mýdlem a vodou.

7 V případě výpadku napájení vypněte elektrické spotřebiče a jejich centralizované napájení. ODDÍL 1. TÉMA VŠEOBECNÉ MIKROBIOLOGIE 1. Morfologie mikroorganismů a metody jejího studia Mikrobiologie studuje organismy mikroskopické velikosti, tzn. měřeno v mikrometrech nebo zlomcích mikrometrů. Jeden mikrometr se rovná 10-6 metrům a je zkrácen jako mikrony. Mikroorganismy se vyznačují intenzivním metabolismem a jsou schopné provádět různé chemické transformace. Různé mikroorganismy se liší jak svou strukturou, tak biochemickými procesy, které provádějí. Jejich sloučení do jedné skupiny je způsobeno nejen jejich malou velikostí, ale také společností metod pěstování a výzkumu. Studovat strukturu mikroorganismů, jejich vzhled, tvar, velikost, tj. ke studiu morfologie mikroorganismů použijte mikroskop. Nejmenší částice, které lze vidět v moderních světelných mikroskopech, jsou více než 1/3 vlnové délky světla, tj. ne méně než 0,2 mikronů, což je spojeno s použitím viditelné části světla s vlnovou délkou od 0,4 mikronu do 0,7 mikronu. Mikroskopické zařízení Obr. 2 ukazuje vzhled mikroskopu MBI-3, který je rozšířen ve výzkumné a vzdělávací praxi. Uvažovaný vzorek je umístěn na jeviště a zespodu osvětlen světelnými paprsky, které vycházejí z iluminátoru, dopadají na zrcadlo, poté procházejí kondenzátorem a zaostří na vzorek. Hlavní části mikroskopu: okuláry, tubus, otočný nástavec s objektivy, jeviště se svorkami pro přípravu, kondenzátor, makro a mikrošrouby pro zaostřování a nakonec stativ, ve kterém je toto vše upevněno. 7

8 Před mikroskopií zkontrolujte správnost instalace osvětlení (podle Koehlera). Chcete -li to provést, pohybem držáku lampy pomocí žárovky dosáhnete jasného obrazu závitu 8

9 žhavení lampy na plně uzavřenou membránu kondenzátoru tak, aby tento obraz zcela vyplnil otvor kondenzátoru. Po zavření clony iluminátoru otevřete membránu kondenzátoru a pohybem kondenzátoru dosáhnete ostrého obrazu membrány iluminátoru v zorném poli mikroskopu. Aby jasné světlo neoslepilo oči, nejprve se sníží vlákno lampy. A nakonec se obraz otvoru clony nastaví do středu zorného pole a otevře se clona iluminátoru, takže se osvětlí celé zorné pole. Mikroskop je optický systém se dvěma stupni zvětšení: první zvětšení je prováděno objektivem, druhé okulárem. Objektiv poskytuje zvětšený zpětný obraz předmětu, který je viděn okulárem. V důsledku toho oko pozorovatele vidí vysoce zvětšený zpětný obraz objektu. Pohyb předmětu doleva je tedy okem vnímán jako pohyb doprava. Celkové zvětšení mikroskopu, tj. Zvětšení, při kterém je objekt pozorován pod mikroskopem, je definováno jako součin zvětšení objektivu a okuláru. Objektivy dávají zvětšení 10, 40, 60, 90krát, okuláry občas. Pokud je použit binokulární nástavec, poskytuje další zvětšení. Na obr. 3 ukazuje schematický diagram optického systému mikroskopu. Objektiv O tvoří v rovině Z skutečný převrácený obraz A objektu A. Obraz daný čočkou se dále zvětšuje pomocí okuláru E. Protože Z je v ohnisku okuláru E, pozorovatel vidí zvětšený virtuální obraz A v rovina X, která se obvykle nachází 25 cm od oka, tj. na vzdálenost nejvhodnější pro vidění na blízko. Je třeba mít na paměti, že taková představa o mechanismu tvorby obrazu je in nejvyšší stupeň zjednodušeně, protože ignoruje vliv difrakce a řadu dalších faktorů. Při práci s mikroskopem studenti studují mikrobiální přípravky se zvětšením v časech. Nejvyšší zvětšení dané optickým mikroskopem je 3000krát. Nejmenší velikost částic, kterou lze v takovém mikroskopu zobrazit, 9

10 se rovná 0,2 μm, což je dáno vlnovou délkou viditelné části spektra. Morfologie mikroorganismů Svět mikroorganismů zahrnuje obrovskou škálu forem, které netvoří jedinou systematickou skupinu. Hlavními předměty mikrobiologie jsou bakterie, ale kromě nich mikrobiologové studují také kvasinky, houby, mikroskopické řasy a některé prvoci. Na obr. 4 ukazuje hlavní skupiny mikroorganismů (s výjimkou prvoků); proporce jejich velikostí jsou zachovány. Všechny živé organismy, kromě virů, mají buněčná struktura... V souladu s jejich buněčnou organizací se dělí na prokaryotické a eukaryotické. deset

11 Hlavní rozdíl mezi eukaryoty a prokaryoty je přítomnost sekundárních dutin, které oddělují jádro a další buněčné struktury od cytoplazmy. Právě výskyt sekundárních dutin umožnil skok v evoluci celého živého světa díky zvětšení vnitřního povrchu eukaryotických membrán. To umožnilo, v souladu se zvýšením rychlosti difúze, současně provádět větší počet biochemických reakcí vyskytujících se na membránách. Prokaryoty jsou bakterie, včetně aktinomycetů a sinic. Eukaryoty jsou všechny rostliny, zvířata, kvasinky, houby, prvoci. Mezi prokaryoty se v současné době rozlišuje skupina archeobakterií, která zahrnuje methanogeny, extrémní halofily, (žijící ve velmi slané vodě) extrémně teplomilné bakterie, které oxidují a snižují molekulární síru, a také termoplazmy, zbavené buněčné stěny. Nové rozdělení bylo provedeno na základě srovnání nukleotidových sekvencí v malých úsecích ribozomální RNA. jedenáct

12 Archebacteria se liší složením buněčných stěn, lipidů a některými dalšími fyziologickými a biochemickými rysy (například mají odlišný mechanismus fixace CO 2). Ve struktuře buněčné organizace se tedy v současné době rozlišují tři skupiny: archea (podle nové nomenklatury Archaea, archaea), eubakterie (podle nové nomenklatury Bakterie, bakterie) a eukaryoty (podle nové nomenklatury z Eukaryi). Práce 1. Mikroskopické studium bakterií Morfologie bakterií Teoretický úvod Tato skupina mikroorganismů je nejpočetnější, v přírodě velmi rozšířená a má velký průmyslový význam. Pro pojmenování mikroorganismů se používá binární nomenklatura, jako v zoologii a botanice. V souladu s touto nomenklaturou má každý druh jméno sestávající ze dvou latinských slov. První slovo znamená rod a druhý druh. Obecný název je vždy psán s velkým písmenem a konkrétní název s malým písmenem. Většina bakterií jednobuněčné organismy kulovité, tyčinkovité nebo spletité. Mezi bakteriemi existuje malý počet vláknitých forem. Bakterie jsou velmi malé, průměr buňky sférických bakterií je 1 2 µm. Bakterie se množí dělením (za příznivých podmínek dochází k dělení během minut). Některé bakterie jsou mobilní. Schopnost pohybu je spojena s přítomností speciálních organel bičíků. Nejjednodušší tvar jsou sférické bakterie (koky). Setkávají se buď ve formě jednotlivých kuliček, nebo koulí propojených. Podle umístění buněk po rozdělení se sférické bakterie dělí na monokoky (jednokoky), tetrakoky (kombinované 4), sarciny (kombinované 8), stafylokoky (shluky), streptokoky (řetězce koků). 12

13 Tyčinkovité bakterie jsou největší skupinou bakterií. Mají válcovitý tvar buňky se zaoblenými nebo špičatými konci a značně se liší v poměru délky k šířce. Mohou být umístěny jednotlivě nebo mohou tvořit krátké nebo dlouhé řetězce. Tyče mohou mít různé délky, obvykle několik mikronů, a šířku asi 1 mikron. Některé tyčinkovité bakterie tvoří uvnitř buňky speciální těla spor. Každá buňka tvoří jednu sporu, která slouží k tomu, aby vydržela nepříznivé podmínky. Výtrus klíčí za vhodných podmínek (teplota, vlhkost, živiny) a mění se v hůl. Rezistence bakteriálních spór je vyšší než u jakéhokoli živého organismu. Například spor sena Bacillus subtilis vydrží teplotu 100 ° C po dobu 3 hodin. Tato odolnost proti sporům ztěžuje boj s infekcemi. Zkroucené mikroorganismy se liší stupněm zakřivení buněk a počtem závitů. Dělí se na vibria, spirály a spirochety. Pokud má bakterie jednu neúplnou spirálu, pak se nazývá vibrio. Pokud má bakterie několik spirálních kadeří, pak se nazývá spirilla a mikroby, které mají stočený tvar s velkým počtem malých kadeří, se nazývají spirochety. Vláknité bakterie jsou vlákna tvořená válcovými nebo diskovitými buňkami. Některé typy nití jsou uzavřeny ve sliznici, která může být impregnována hydroxidem železa nebo solemi manganu. K akumulaci těžkých kovů z roztoků dochází v buňkách některých železných bakterií. Velké vláknité bakterie str. Beggiatoa ukládá síru do svých buněk. Vláknité bakterie obvykle žijí v moři a sladkých vodách, nacházejí se také v rozkládajících se organických zbytcích, ve střevech zvířat. Sinice zahrnují velkou skupinu organismů, které kombinují prokaryotickou strukturu buňky se schopností provádět fotosyntézu. Buněčné pigmenty sinic, kromě chlorofylu a (zelené), obsahují fykocyaninový pigment 13

14 modrá. Z tohoto důvodu se jim dříve říkalo modrozelené řasy. Většinou jde o mnohobuněčné organismy, což jsou dlouhá, nejčastěji nerozvětvená vlákna (trichomy). Buňky ve vláknech jsou spojeny společnou vnější stěnou. Někdy se tvoří slizniční akumulace „rohoží“. Reprodukce se provádí rozdělením vlákna na samostatné části. Některé druhy se pohybují klouzáním (str. Spirulina). Aktinomycety (větvící se bakterie, zářivé houby) jsou velkou skupinou prokaryotických mikroorganismů, které vytvářejí tenká rozvětvená vlákna o délce několika mm a průměru 0,5–1,5 µm. Jedná se o zvláštní skupinu mikroorganismů, která morfologicky připomíná plísně (obr. 5). Buňky významné části zástupců této skupiny jsou schopné větvení, což je charakteristický rys hub. Délka rozvětvených vláken aktinomycetů však dosahuje několika milimetrů, zatímco délka mycelia hub je několik centimetrů. Hyfy hub jsou obvykle několikrát silnější než vlákna aktinomycetů. Podle morfologie a vývoje se aktinomycety dělí na vyšší a nižší formy. Nejvyšší jsou organismy s dobrými 14

15 vyvinulo septické nebo neseptické mycelium a speciální sporulační orgány. Výtrusy se vytvářejí ve formě řetězců na speciálních spóronosných hyfách vzdušného mycelia. Struktura sporulačních orgánů je u různých druhů odlišná: dlouhá nebo krátká, rovná nebo spirálová (obr. 6). Přítomností mycelia a strukturou sporulačních orgánů se vyšší aktinomycety podobají vláknitým houbám. Některé aktinomycety mají mycelium pouze v mladé kultuře, která se s věkem rozpadá a vytváří tyčinkovité a kokidní buňky. Nižší formy aktinomycet nemají skutečné mycelium. Schopnost tvořit mycelium je v nich vyjádřena pouze tendencí buněk k větvení. Mezi nižší aktinomycety patří například druhy rodu Mycobacterium, které mají schopnost měnit tvar buněk s věkem kultury (obr. 7). Tato vlastnost se nazývá pleomorfismus. Mezi vyššími aktinomycety zaujímají přední místo z hlediska hojnosti v přirozeném prostředí druhy rodu Streptomyces. Aktinomycety hrají důležitou roli v procesech 15

16 tvorba půdy a tvorba úrodnosti půdy. Aktinomycety ničí složité organické sloučeniny (celulóza, humus, chitin, lignin atd.), Které jsou pro mnoho dalších mikroorganismů nepřístupné. Téměř všechny druhy rodu Streptomyces tvoří specifické odpadní produkty s antibiotickými vlastnostmi. Některé druhy jsou původci chorob rostlin, zvířat a lidí. Kromě hlavních forem bakterií existují stonkové a pučící bakterie nesoucí výrůstky, nazývané protézy. (obr. 8) 16

17 Funkce stehů jsou různé. U některých bakterií slouží k reprodukci, u jiných k přichycení buňky k substrátu. 17

18 18 Praktická část Účelem práce je studium morfologie zástupců bakterií Postup při provádění práce Provedením první práce se studenti naučí používat mikroskop, podívají se na hotové přípravky zástupců bakterií, poté samostatně připraví preparáty živých bakterií a mikroskopujte je. Nejprve studenti mikroskopické hotové fixní preparáty bakterií. Fixované přípravky jsou mikroorganismy suspendované ve vodném médiu, sušené na sklíčku a obarvené anilinovými barvivy. Studenti si sami připravují přípravky některých živých mikroorganismů. Za tímto účelem se na čisté skleněné podložní sklíčko nanese malá kapka vody z vodovodu, do které se pomocí kalcinované a chlazené bakteriologické smyčky zavede malé množství studovaných mikrobů, důkladně se promíchá a přikryje krycím sklem. Přebytečná voda se odstraní filtračním papírem. Vzorek je umístěn na pódium a zajištěn svorkami. Nejprve při pohledu okulárem a otáčením makrošroubu dosáhnou ostrého obrazu předmětu při malém zvětšení s 10x objektivem. Poté je mikroskop přenesen do vysokého zvětšení s 40x objektivem. Otáčení šroubů je třeba provádět opatrně, protože pokud je spouštění příliš ostré, objektiv může být rozdrcen objektivem. Při mikroskopování je třeba mít na paměti, že mikroskop, zejména při vysokých zvětšeních, nezachycuje celou hloubku objektu, proto když se trubice postupně spouští pomocí mikrošroubu, je předmět nejprve viděn shora , a poté v optické sekci. 1. Zobrazení fixních preparátů mikroorganismů. Lactococcus lactis činidlo pro fermentaci kyseliny mléčné; tvar buněk je sférický koky; buňky jsou spojeny v řetězech. Používá se k získání produktů kyseliny mléčné.

19 Lactobacillus acidophilum tyčinkovité bakterie; původce fermentace kyseliny mléčné. Používá se k získání produktů kyseliny mléčné. Acetobacter aceti jsou tyčinkovité bakterie, které oxidují ethanol na kyselinu octovou. Používá se k výrobě jedlého octa. Aktinomycete Streptomyces griseus, tvar buňky ve formě tenkých rozvětvených vláken; výrobce antibiotika streptomycinu. Aktinomycety Saccacharopolyspora erythrae, tvar buňky ve formě tenkých rozvětvených vláken; výrobce antibiotika erythromycinu. 2. Zobrazení živých preparátů buněk Bacillus subtillis ve formě tenkých pohyblivých tyčinek; tvoří spory; výrobce enzymových přípravků. Sinice Spirulina platensis; tvar buněk ve formě jediného vlákna, skládajícího se z válcových buněk, těsně přiléhajících k sobě; má posuvný pohyb. Používá se jako přísada do potravin. Obsah zprávy 1. Latinský název mikroorganismu. 2. Buněčná morfologie (dejte kresbu ukazující zvětšení mikroskopu a dodržení poměru velikosti buněk). 3. Využití studovaných bakterií v průmyslu. Kontrolní otázky 1. Popište konstrukci mikroskopu. 2. Jak určit zvětšení mikroskopu? 3. Jaký je tvar bakteriálních buněk. 4. Vyjmenujte rysy morfologie aktinomycet. 5. Jaké zástupce bakterií znáte a jaké jsou jejich praktický význam? Práce 2. Morfologie eukaryotických mikroorganismů Teoretický úvod 19

20 Eukaryotické mikroorganismy zkoumané mikrobiology zahrnují houby, kvasinky, mikrořasy a některé prvoci. Morfologie hub Houby jsou mikroorganismy bez chlorofylu s vláknitými buňkami. Dlouhá, rozvětvená vlákna, která tvoří, se nazývají hyfy. Hyfy dohromady tvoří mycelium. Pokud jde o jejich velikost, houbové hyfy jsou mnohem větší než aktinomycety. Mycelium v ​​řadě forem je rozděleno přepážkami (septické mycelium), zatímco jiné druhy septa chybí. V biotechnologiích se jako výrobci používají hlavně formy. Někteří zástupci phycomycetů, vačnatců a nedokonalých hub se nazývají „plísňové houby“. Na hustých substrátech plísně tvoří kulaté, nadýchané, pavučinové, bavlněné nebo práškové kolonie zelené, nažloutlé, černé nebo bílé barvy. Kolonie plísní se skládají z velkého počtu hyf. Většina hyf se vyvíjí ve vzduchu a některé v tloušťce substrátu. Na hyfách se často tvoří konidiofory, na kterých se tvoří spóry buď uvnitř sporangia, nebo ve formě exospor, uspořádaných do řetězců. Konidiespory nebo konidie slouží nepohlavní rozmnožování(obr.10). Konidie, které se dostaly do příznivých podmínek, vyklíčily do mycelia. Plísně jsou v přírodě velmi rozšířené a mají silný enzymatický aparát. Proto jsou hlavními ničiteli organických sloučenin v přírodě. Formy jsou také široce používány v průmyslu pro výrobu organických kyselin, antibiotik a enzymů. dvacet

21 Morfologie kvasinek Kvasinky jsou samostatnou skupinou jednobuněčných mikroskopických hub velkého praktického významu. Buňky kvasinek jsou velké kulaté nebo oválné buňky (obr. 11). Některé kvasinky mohou tvořit primitivní mycelium zvané pseudomycelium. Velikost buněk se pohybuje od 3 µm do 10 µm na délku a 2 až 8 µm na šířku. Většina kvasinek se rozmnožuje pučením. Navíc ve 21

Na povrchu buňky se objeví malá boule ledviny (někdy ne jedna, ale několik), postupně se zvětšuje a nakonec se odděluje od buňky, která ji produkuje. Ledvina oddělená od mateřské buňky se stává novou kvasinkovou buňkou. Některé kvasinky se množí dělením. V jemnozrnném obsahu živých kvasinek (protoplazma) jsou jasně viditelné velké vakuoly. Vakuoly jsou dutiny uvnitř protoplazmy naplněné buněčnou mízou. Skládá se z elektrolytů, bílkovin, sacharidů a enzymů rozpuštěných ve vodě. V mladých kvasinkových buňkách je protoplasma homogenní a v pozdějších fázích vývoje se vakuopoly objevují v protoplazmě naplněné buněčnou mízou s metabolickými produkty. Když je živné médium vyčerpáno, u mnoha kvasinek dochází ke sporulaci. U některých druhů kvasinek jsou spóry kulaté a pokryté hladkou skořápkou. Za příznivých podmínek klíčí spóry. Kvasinky jsou v přírodě rozšířené. Nacházejí se na hroznech, jiných bobulích a ovoci, mléce, vodě a půdě a na lidské kůži. Mnoho kvasinek provádí alkoholové kvašení a používá se k výrobě alkoholu v pekařství, vinařství a pivovarnictví. 22 Morfologie prvoků Protozoa jsou jednobuněčné organismy zvířecího světa. Mezi mikroorganismy jsou nejkomplexněji uspořádány a mají primitivní orgány charakteristické pro mnohobuněčná zvířata. Některé z nich mají ústní a anální otvory, kontraktilní a trávicí vakuoly. Prvoci se rozmnožují nepohlavně (dělením buněk) a sexuálně. Klasifikace prvoků je založena na režimech pohybu. 1. Sarcodes. Pohybují se a popadají jídlo pomocí pseudopodie neboli falešných nohou. Amoeba je typický zástupce. Velikost améb nepřesahuje mikrony.

23 2. Bičíky. Mají hustou plazmatickou membránu a pohybují se pomocí bičíků. Půdní formy bičíků jsou velmi malé (2 5 µm) a vodní formy jsou velké (až 20 µm). Typickým představitelem je Euglena. 3. Ciliární. Nejvíce organizované prvoky. Velikost buněk se pohybuje od 20 do 80 mikronů. Typickým zástupcem je ciliate-bot Paramecium, který se pěstuje pro krmení rybího potěru. 4. Sporozoans. Opravené formuláře. Mnoho patogenů, jako je Plasmodium malaria. Prvoci jsou v přírodě rozšířeni. Nacházejí se ve vodních útvarech, v bahně a půdě. Význam prvoků v přírodě je velmi rozmanitý. Žijí v gastrointestinálním traktu různých zvířat, podílejí se na trávení rostlinné potravy, podílejí se na mineralizaci organických zbytků v půdě a jsou také důležitou součástí biocenózy v léčebných zařízeních. Živí se bakteriemi a suspendovanými pevnými látkami a pomáhají čistit vodu. Ty nejjednodušší plní funkci indikátorů: podle vývoje určitých forem lze posoudit kvalitu čištění odpadních vod. Převaha améb a absence ciliatů v aktivovaném kalu naznačuje špatný výkon zařízení na zpracování. Ciliát Tetrahymena je široce používán pro počáteční hodnocení toxicita. Různé druhy prvoků jsou znázorněny na obr. 12. Morfologie řas Řasy jsou velkou skupinou rostlinných organismů. Společná pro všechny je přítomnost chlorofylu a výsledná fotoautotrofní výživa, schopnost syntetizovat organickou hmotu pomocí energie sluneční světlo a kysličník uhličitý. V mnoha řasách je zelená barva chlorofylu maskována jinými pigmenty. Mezi nimi jsou velmi malé jednobuněčné a mnohobuněčné formy připisované mikroorganismům, stejně jako 23

24 mnohobuněčných organismů, které žijí v mořích a oceánech a někdy dosahují obrovských rozměrů.Cílem studia mikrobiologie jsou některé řasy mikroskopické velikosti. Mají různé formy a žijí jak na souši, tak ve vodním prostředí (obr. 13). 24

25 Praktická část Cílem práce je studium morfologie zástupců různých skupin eukaryot. Postup při provádění práce Studenti samostatně připravují živé přípravky zástupců hub, kvasinek, řas a prvoků; jsou mikroskopovány objektivem x40 a načrtnuty s indikací zvětšení mikroskopu. Formy Aspergillus niger tvoří buňky ve formě mycelia se septami; některé hyfy mají nerozvětvené konidiofory se spory. Konidiofory jsou jednobuněčné, kulovitě nabobtnalé, na povrchu bobtnání jsou krátké buňky ve tvaru půllitru (sterigmy), z nichž každý se zavazuje podél řetězce černě zbarvených konidií. Používá se k získání organických kyselin a enzymů. Penicillium chrysogenum hyphae mají septa; na některých hyfách jsou rozvětvené konidiofory se spory. Konidie se tvoří na koncích přeslenitě rozvětvených konidioforů. Používá se k získání antibiotika penicilin. 25

26 Kvasnicové Saccharomyces cerevisiae solitérní kvasinky s oválnými a kulatými buňkami; rozmnožovat pučením. Používají se při vaření, pečení, výrobě alkoholu. V přírodě se nacházejí na povrchu bobulí a jiného ovoce. Buňky Saccharomyces vini jsou oválné a kulaté; reprodukovat pučením; po pučení se nějakou dobu neoddělují a tvoří malé „větve“. Používají se při výrobě vína. Buňky Rhodotorula glutinis jsou eliptické; buňky jsou jediné; rozmnožovat pučením. Díky obsahu karotenoidů v buňkách jsou zbarveny oranžově. Může růst v prostředí s ropnými uhlovodíky jako zdrojem uhlíku. Používá se jako krmné droždí. Kvasinky Candida tropické s oválnými a vysoce prodlouženými buňkami, tvořící „pseudomycelium“. Může růst v minerálním prostředí s uhlovodíky jako zdrojem uhlíku. Používá se jako krmné droždí. V průmyslovém měřítku se pěstují na odpadech z výroby alkoholu a papíru. Algae Chlorella vulgaris je mikroskopická zelená řasa se zaoblenými buňkami (průměr 5-10 mikronů); reprodukovat autospory, které se tvoří uvnitř mateřské buňky v množství od 4 do 32 a uvolňují se po prasknutí její membrány. Mohou být použity pro hromadné pěstování za účelem získání krmných bílkovin, stejně jako pro regeneraci vzduchu v uzavřených systémech (ponorky, vesmírné stanice atd.). Scenedesmus sp. patří do skupiny zelených řas; má oválný tvar buňky; vnější buňky jsou často špičaté; buňky jsou spojeny dohromady ve čtyřech. Používá se k získání potravinových bílkovin. 26

27 Protozoa Přípravek se připravuje z aktivovaného kalu provzdušňovací nádrže. Prostudujte morfologii nalezených prvoků a načrtněte je. Obsah zprávy 4. Latinský název mikroorganismu. 5. Buněčná morfologie (dejte kresbu ukazující zvětšení mikroskopu a dodržující poměr velikostí buněk). 6. Využití studovaných mikroorganismů v průmyslu. Kontrolní otázky 1. Popište tvar buněk zástupců hub a jejich praktické využití. 2. Popište tvar kvasinkových buněk; pojmenujte zástupce a řekněte o jejich praktickém použití. 3. Povězte nám o morfologii mikrořas a jejich praktickém využití. 4. Jmenujte zástupce nejjednodušších a řekněte o jejich aplikaci v biotechnologiích. Práce 3. Metody studia morfologie mikroorganismů Nejběžnější metodou studia morfologie bakterií je mikroskopie fixovaných přípravků připravených z čistých kultur mikroorganismů nebo ze zkušebního vzorku. Studium mikroorganismů v živém stavu se používá při studiu větších forem a pozorování pohyblivosti buněk. Příprava fixních přípravků z mikroorganismů K přípravě fixních přípravků z mikroorganismů se nejprve připraví nátěr, suší se, fixuje a poté se barví. Nátěry jsou připraveny na dokonale čistých sklech. Sklenice můžete odmastit ethylalkoholem, směsí stejných objemů alkoholu a etheru a dalšími 27

28 kapalin. Nejjednodušší a nejpohodlnější způsob, jak odmastit brýle, je otřít je z obou stran kouskem mýdla na prádlo. Mýdlo se ze sklenice odstraní kouskem suché vaty nebo ubrouskem. Při výrobě nátěru z kolonie bakterií pěstovaných na agarovém médiu se nejprve do odtučněné sklenice nanese kapka vody nebo fyziologického roztoku. Poté se bakteriologická smyčka zapálí v plameni hořáku. Poté, po ochlazení smyčky na vnitřní stěně trubice, je část kolonie bez agaru zachycena smyčkou. Kultivační smyčka se umístí do kapky vody nebo fyziologického roztoku na sklenici a provedou se 2 3 kruhové pohyby. Některé z bakterií jsou suspendovány v kapalině. Přebytečné bakterie zbývající na smyčce se spálí v plameni hořáku a ohřívá smyčku do červena. Poté vychladlou smyčkou namažte kapku suspenze na sklo. Plocha nátěru by měla mít průměr 1,5–2 cm. Nátěr by měl být tenký s rovnoměrným rozložením materiálu. Pokud je nátěr připraven z kultury pěstované v tekutém živném médiu, pak při dodržení stejných pravidel sterility odeberte kapku kultury smyčkou nebo pipetou a naneste ji doprostřed odtučněné sklenice. Pipeta se zbytkem kultury se ponoří do nádoby s dezinfekčním roztokem. Kapka je rovnoměrně rozložena po skle s bakteriologickou smyčkou. Smyčka je spálena plamenem hořáku a umístěna do stativu nebo skla. Nátěr se suší na vzduchu nebo v proudu teplého vzduchu a drží ho za podélná žebra vysoko nad plamenem hořáku. Hranice nátěru jsou naznačeny voskovou tužkou na zadní straně sklenice a na stranu nátěru na jeden z konců sklenice je uvedeno číslo přípravku. Podle těchto značek můžete snadno navigovat v místě rozmazání na skle. Zaschlý nátěr je zafixován. Fixace má následující cíle: 1) zabít bakterie, díky čemuž je lék bezpečný další práce; 2) připevněte na sklo mikroby, aby se při malování a oplachování vodou nesmyly; 3) zlepšit vnímavost barvy. 28

29 Nejjednodušší metodou, vhodnou téměř pro všechny mikrobiologické předměty a v praxi nejrozšířenější metodou, je fixace v plameni hořáku. Za tímto účelem se sklíčko 3-4krát nechá projít nejžhavější horní částí plamene hořáku, čímž se zabrání nadměrnému přehřátí přípravku, aby nedošlo k denaturaci bílkovin a narušení struktury a morfologie bakterií. Rozlišujte jednoduché a komplexní metody diferenciálního malování. Jednoduché barvení se používá k detekci mikrobů v testovaném materiálu, ke stanovení jejich počtu, tvaru a umístění. Jednoduché barvení spočívá v nanesení jediného anilinového barviva na přípravek. Nejčastěji se pro tyto účely používá červený fuchsin a také alkalický roztok methylenové modři (Lefflerova modř) modré. Technika barvení: dobře fixovaný vzorek se nanese stěrem nahoru na skleněný můstek nad lázní. Jedna z těchto barev se nanáší na povrch nátěru pipetou nebo z kapátka. Fuchsin se udržuje na nátěru 1–3 minuty a modrý 3–5 minut. Z nátěru se odstraní barva, přípravek se promyje vodou, vysuší na vzduchu nebo opatrně přefiltruje filtračním papírem. Na vysušený nátěr se nanese kapka imerzního oleje, přípravek se umístí na mikroskopický stolek a mikroskopuje se imerzním objektivem (90) v procházejícím světle. Diferenciální metody barvení bakterií. Propracované techniky barvení jsou zásadní pro identifikaci a rozlišení různých typů mikrobů. Jsou založeny na zvláštnostech fyzikálně -chemické struktury mikrobiální buňky a slouží k podrobnému studiu buněčné struktury a identifikaci charakteristických rysů ve vztahu k některým barvivům. U těchto metod je nátěr obarven několika barvami a dodatečně ošetřen mořidly nebo odbarvovacími činidly s alkoholem, kyselinou atd. Tyto metody zahrnují nejdůležitější způsob barvení pro rozlišení bakterií, Gramovo barvení. Tato metoda odhaluje 29

Schopnost bakterií zadržovat barvivo nebo odbarvit v alkoholu, což souvisí s chemickou strukturou buněčné stěny. Podle struktury buněčné stěny jsou všechny bakterie rozděleny do dvou skupin: 1) grampozitivní barvení podle Gramů a 2) gramnegativní barvení nebarvící podle Gram. Postoj k Gramovu barvení je tak důležitou diferenciální charakteristikou bakterií, že je nezbytně uveden při jejich charakterizaci a slouží jako taxonomický znak. Technika barvení 30 gramů Na fixovaný nátěr se položí proužek filtračního papíru předem impregnovaný genciánovou fialkou. Na proužek naneste 3–5 kapek vody z vodovodu. Po 1–2 minutách se papír pinzetou odstraní a na přípravek se nalije Lugolov roztok. Po 30 sekundách a 1 minutě se Lugolov roztok vylije. Aplikuje se několik kapek 96 O alkoholu. Odbarveno po dobu 1 minuty, dokud nezmizí šedavě fialové pruhy. Preparát se promyje vodou. Fuchsin se nalije na nátěr a udržuje se 1 2 minuty. Barva se scedí, přípravek se promyje vodou, vysuší filtračním papírem. Mikroskopický s ponorným systémem. Grampozitivní bakterie jsou zbarveny fialově modře (například tyčinka pro fermentaci kyseliny máselné Clostridium pasteurianum) a gramnegativní bakterie se zbarví do růžova-červena (E. coli Escherichia coli). Kromě této tradiční Gramovy techniky barvení existuje rychlá a snadná metoda pro Gramovu diferenciaci bez barvení. Bakteriální buňky (nejlépe 1–2 dny staré) se umístí do smyčky v kapce 3% KOH na skleněné podložní sklíčko, míchají se kruhovým pohybem a po 5 až 8 s se smyčka prudce zvedne. Suspenze gramnegativních bakterií se stává viskózní a táhne se za smyčkou a vytváří slizniční šňůry. Grampozitivní bakterie jsou rovnoměrně rozloženy v kapičce alkálie (jako ve vodě). Reakce je považována za negativní, pokud není do 60 s pozorována tvorba sliznic. Zvýšení viskozity je způsobeno lýzou buněčných stěn gramnegativních bakterií v roztoku

31 uvolňování alkálií a DNA. Metoda bakteriální diferenciace podle Gramů bez barvení by měla být použita pouze pro předběžnou diagnostiku nebo pro výpočet přibližného poměru kolonií grampozitivních a gramnegativních bakterií. Detekce živých a mrtvých buněk barvením methylenovou modří Počet živých a mrtvých buněk lze určit barvením roztokem methylenové modři. Metoda je založena na rozdílné propustnosti živých a mrtvých buněk mikroorganismů. Buněčná propustnost v mrtvých buňkách je narušena, takže barvivo volně prochází cytoplazmatickou membránou a je adsorbováno protoplasmou. Pod mikroskopem se mrtvé buňky zdají modré, živé buňky jsou bezbarvé nebo světle modré. Zbarvení se provádí následujícím způsobem: kapka 2% roztoku methylenové modři se nanese na skleněné podložní sklíčko, překryje krycím sklem a přebytečná barva se odstraní kusem filtračního papíru. Droga se prohlíží pod mikroskopem, v 10 zorných polích se spočítá počet živých a mrtvých buněk; počet mrtvých buněk je vyjádřen v%. Příklad: průměrný počet živých buněk v jednom zorném poli je 10, průměrný počet mrtvých buněk v jednom zorném poli je 5, celkový počet buňky v jednom zorném poli buněk 100% 5 buněk X X 33,3% 15 Počet mrtvých buněk ve studované suspenzi mikroorganismů byl tedy 33,3%. Stanovení velikostí buněk Pro stanovení velikosti buněk mikroorganismů je nutné mít speciální okulár s měřítkem (mikrometr okuláru) a mikrometrický předmět. Oční mikrometr, 31

32 v nejjednodušším případě je skleněný kotouč s vytištěným lineárním měřítkem, který je zasunut do okuláru (obr. 14a). Mikrometrický předmět je mikroskopické podložní sklíčko, v jehož středu je vyryto lineární měřítko o délce 1 mm s odstupňováním 10 mikronů. Před měřením je nutné určit hodnotu dělení mikrometru okuláru pro každé zvětšení mikroskopu. Za tímto účelem je na stupeň mikroskopu umístěn mikrometrický předmět, který je považován za přípravek; v tomto případě je jedna z viditelných divizí mikrometru objektu zarovnána s nulovou značkou stupnice mikrometru okuláru a je zaznamenána shoda dělení obou stupnic (obr. 15). V tomto segmentu se počítá počet očních a objektivních dělení a vypočítává se cena divizí očního mikrometru. Pokud se poté na místo mikrometrického předmětu umístí preparát z mikroorganismu a zkoumá se 32

33 při stejném zvětšení je možné měřit velikost mikrobiální buňky pomocí měřítka mikrometru okuláru jako pravítka. Pro přesná měření se používá speciální mikrometr okuláru s klouzavou nulovou značkou spojený s měřicím bubnem (obr. 14b). Umožňuje určit velikost mikroorganismů s přesností na desetiny mikronů. Nulová značka je dvojitá svislá čára, jejíž střed odpovídá průsečíku dvou tenkých čar ve formě kříže. Před měřením je nutné znát dělení stupnice měřicího bubnu. Referenčním objektem je mikrometr. Otáčením měřícího bubnu je několik dílků stupnice objekt-mikrometr zakroužkováno nulovou značkou. Dvojitá svislá čára ukazuje počet úplných otáček měřicího bubnu. Při provádění měření mikroorganismů posuňte značku nuly podél objektu a odečtěte hodnoty měřicího bubnu. Praktická část Cílem práce je zvládnutí základních metod studia morfologie mikroorganismů. 33

34 Postup při provádění práce 1. Připravte fixní přípravky bakterií mléčného kvašení z biokefiru a acidophilus. 2. Proveďte Gramovo barvení buněk Bacillus subtilis (gram +) a Escherichia coli (gram-). 3. Určete velikost kvasinkových buněk Saccharomyces cerevisiae. 4. Určete počet živých a mrtvých buněk Saccharomyces cerevisiae v kvasinkové suspenzi. 34 Obsah zprávy 1. Morfologie buněk bakterií mléčného kvašení (obrázky fixních přípravků bakterií mléčného kvašení, indikující zvětšení mikroskopu). 2. Kresby fixních preparátů gramnegativních a grampozitivních bakterií. 3. Stanovení měřítka měřicího bubnu mikrometru okuláru. 4. Velikosti kvasinkové buňky Saccharomyces cerevisiae. 5. Počet živých a mrtvých buněk v kvasnicové suspenzi. Testovací otázky 1. Jak připravit fixní přípravek z bakterií? 2. Jaký je důvod rozdílu v bakteriích v Gramově barvení? 3. Co je to Gramovo barvení? 4. Jak určit velikost mikroorganismů? 5. Jak určit počet živých a mrtvých buněk mikroorganismů barvením methylenovou modří? Téma 2. Kultivace mikroorganismů: zásady kompilace živných médií; sterilizační metody; metody očkování a resekce mikroorganismů. Klasifikace a příprava kultivačních médií Kultivovat mikroorganismy znamená uměle vytvářet podmínky pro jejich růst. Pro pěstování

V laboratoři nebo v průmyslu se používá 35 mikroorganismů, živná média obsahující všechny látky nezbytné pro životně důležitou činnost mikroorganismů. Z prostředí vstupují živiny do buňky mikroorganismu a metabolické produkty jsou z buňky odváděny do prostředí. Pro život mikroorganismů je potřeba voda, uhlík, kyslík, dusík, síra, fosfor, draslík, vápník, hořčík, železo a stopové prvky. Všechny tyto látky musí být obsaženy v živném médiu. I bez jednoho z nich nedojde k žádnému růstu, nebo bude bezvýznamný. Uhlík, vodík, dusík, fosfor a síra se nazývají biogenní prvky, protože tvoří asi 90–95% suché hmotnosti buněk. Draslíku, hořčíku, vápníku a sodíku se říká makronutrienty neboli prvky popela. Představují až 5-10% suché hmotnosti buněk. Železo, mangan, molybden, kobalt, měď, vanad, zinek, nikl a některé další kationty těžkých kovů se nazývají stopové prvky a tvoří zlomek procenta suché hmotnosti buněk. Nejvyšší hodnota má uhlík pro jakýkoli živý organismus. Je součástí všech organických molekul v buňce a tvoří asi 50% suché biomasy. Ve vztahu k uhlíku jsou všechny organismy rozděleny na autotrofní a heterotrofní. Autotrofové používají jako zdroj uhlíku oxid uhličitý. Heterotrofové potřebují hotové organické sloučeniny. Různé organické látky mohou sloužit jako zdroj uhlíku pro většinu mikroorganismů: bílkoviny a produkty jejich rozpadu, sacharidy, tuky, uhlovodíky. Dusičnatá výživa je svou hodnotou na druhém místě po uhlíkové výživě. Dusík je složkou aminokyselin a dalších buněčných složek, které zajišťují vitalitu organismů. Dusík tvoří 14% sušiny buněk. Zdrojem dusíku jsou organické nebo minerální sloučeniny obsahující dusík. Zdroje minerálního dusíku jsou nejčastěji amoniové soli a dusičnany. Proteiny, aminokyseliny, nukleotidy se používají jako organické zdroje dusíku. Některé prokaryoty mohou používat atmosférický dusík. 35

36 Fosfor a síra jsou důležité buněčné biopolymery. Fosfor (3% sušiny) je součástí nukleotidů a ATP a síra (méně než 1%) je součástí některých aminokyselin. Fosfáty se obvykle používají jako zdroj fosforu a sírany se používají jako síra. Fosfor a síru lze také použít jako organické sloučeniny. Pro růst mikroorganismů je zapotřebí malé množství makroprvků: ionty alkalické kovy(Na +, K +) a kovy alkalických zemin (Mg 2+, Ca 2+), které hrají důležitou roli v životě mikroorganismů. Makronutrienty v mikrobiálních buňkách jsou nezbytné k regulaci propustnosti, osmotického tlaku, hodnoty pH. Kromě těchto kovů je pro růst mikrobů zapotřebí řada stopových prvků (stopových prvků). Minerální složení živného média tvoří distribuci elektrických nábojů na povrchu buňky. Změna elektrického potenciálu buněk může změnit jejich fyziologickou aktivitu. Jednou z hlavních funkcí stopových prvků je účast na enzymatické katalýze. V současné době je působení jedné čtvrtiny všech enzymů v buňce spojeno s kovy. Kromě hlavních složek živného média pro normální vývoj některých mikrobů jsou potřeba i další látky, kterým se říká „růstové faktory“. Růstové faktory jsou kombinovaným názvem různých chemická podstata připojení. Jde především o organické látky, jejichž přidání ve velmi malých množstvích stimuluje růst a reprodukci mikroorganismů. Pro mikroby mají stejný význam jako vitamíny pro vyšší organismy. Růstovými faktory jsou především vitamíny B, které hrají roli regulátorů a stimulátorů metabolismu u mikrobů, neboli aminokyselin. Jako růstové faktory se používá kvasinkový autolyzát, kvasnicový extrakt, nativní proteiny (krev, sérum) atd. Nutriční požadavky mikroorganismů jsou velmi rozmanité. Z tohoto důvodu neexistuje univerzální 36

37 médium, stejně vhodné pro kultivaci jakéhokoli mikroorganismu. V závislosti na cílech kultivace a potřebách daného mikroorganismu se živná média liší třemi způsoby: složení, fyzický stav a účel. Podle složení jsou živná média rozdělena do dvou skupin: 1) přírodní (přírodní); 2) umělé (syntetické). Přírodní prostředí jsou ta, která mají nedefinované chemické složení, protože zahrnují produkty rostlinného nebo živočišného původu, odpad z různých průmyslových odvětví, obsahující organické sloučeniny. Přírodní živná média poskytují intenzivní růst široké škály mikroorganismů. Obsahují bohatou škálu organických a anorganické sloučeniny, včetně všech nezbytných prvků a dalších látek. V laboratorních podmínkách se například nejčastěji používají následující kultivační média. 1. Maso-peptonový vývar (MPB) z masa, obsahuje produkty neúplného rozkladu proteinových peptonů, které obsahují organický uhlík, organický dusík, organické látky obsahující fosfor a síru. BCH také obsahuje všechny minerály nezbytné pro mikroorganismy. BCH se používá při kultivaci mnoha druhů bakterií. 2. Výtažek z mladiny z naklíčených zrn ječmene, obsahuje cukr (hlavně maltózu), dusíkaté látky, prvky popela, různé růstové faktory a vitamíny B jako zdroj uhlíku. Pivní mladina je dobrým prostředím pro vývoj mnoha mikroorganismů, zejména kvasinek plísňové houby. Dobrým přírodním médiem je mléko, brambory, ovocné a zeleninové odvary. V průmyslu se obvykle používají polosyntetická nebo přírodní média. Jako zdroj uhlíku se velmi často používá mikrobiologický nebo mikrobiologický odpad. Potravinářský průmysl: melasa (odpad z výroby cukru), 37

Ministerstvo zemědělství Ruské federace FEDERÁLNÍ RYBOLOV AGENTURA KAMCHATSK STÁT TECHNICKÁ UNIVERZITA ODDĚLENÍ BIOLOGIE A CHEMIE CHEMIE A MIKROBIOLOGIE PŘÍPRAVA VODY

Příjmení Kódové jméno Pracoviště Okresní kód Celkem: Úkoly praktického kola regionální fáze XXXII. BIOCHEMIE. IDENTIFIKACE EXTRAKTU Zařízení: Zkumavky (3 zkumavky s extrakty

Příjmení Kód Název Okres / město Kód pracoviště Celkem: ÚLOHY praktického kola regionální fáze XXVIII Všeruské olympiády pro školáky z biologie. Akademický rok 2011-12 rok. BIOCHEMIE TŘÍDY 11. Zařízení,

MIKROBIOLOGIE VYSVĚTLUJÍCÍ K PRACOVNÍMU PROGRAMU KURZU "Mikrobiologie", ročník 9 "na základě autorského programu volitelného kurzu" Mikrobiologie "Averchinkova OE Biologie. Volitelné předměty... Léčebný

ÚKOLOVÁ MIKROBIOLOGIE (max. 20 bodů) Účel práce: Příprava a analýza drog ze dvou známých fermentované mléčné výrobky... Vybavení: mikroskopy, hořáky nebo lihové lampy, skleněné diapozitivy,

KRÁLOVSTVÍ PROKARYOTŮ KRÁLOVSTVÍ BAKTERIÍ Bakterie jsou klasifikovány jako prokaryoty. Jedná se o nejjednodušší, nejmenší a nejrozšířenější organismy, které na Zemi existují více než 2 miliardy let, ale společně

Systém ORGANICKÝ SVĚT Všechny organismy existující na Zemi jsou rozděleny do čtyř království: Drobyanki, houby, rostliny, zvířata. Brokovnice patří mezi prokaryoty (předjaderné organismy), houby, rostliny,

Téma projektu Výzkum mikroorganismů žijících ve stojaté nádrži lesa Butovo v Moskvě Autoři: Kasaeva Diana, Kasaeva Kristina, Tkachenko Alisa Škola: GBOU SOSH 1945 Třída: Stupeň 5 Vedoucí:

Laboratorní práce „Struktura těl kloboukových hub“ Účel: studovat stavbu těl čepičkových hub Vybavení: capové houby (bílá houba, russula, žampión, hřib, máslová mísa, medové houby atd.), Hotové- vyrobeno

FEDERÁLNÍ STÁTNÍ VZDĚLÁVACÍ INSTITUCE VYŠŠÍHO PROFESIONÁLNÍHO VZDĚLÁVÁNÍ „OMSK STATE AGRARIAN UNIVERSITY NAMED AFTER PA PA STOLYPIN“ INSTITUT VETERINARY MEDICINE AND BIOTECHNOLOGY

Schváleno zástupcem hlavního státního hygienického lékaře Ruské federace - vedoucím lékařem Federálního centra pro státní hygienický a epidemiologický dozor Ministerstva zdravotnictví Ruska E. N. Beljajeva 20. února 2004 N 24FC / 900 Datum

Výzkumná práce Kvasinky: vzrušující život malých hub Autor: student 5 "B" třída GBOU Gymnasium 1748 "Vertikální" Kutaytsev Georgy Valerievich Vedoucí: Nosova Elena Vladimirovna,

Metoda detekce kvasinek a plísní v potravinách METODICKÉ DOPORUČENÍ Metody detekce kvasinek a plísní v potravinách: Metodická doporučení - Moskva: Federální centrum

Téma 4. Bakterie. Houby. Lišejníky. Část A. 1. Přítomnost sinic v lišejníku zajišťuje 1) absorpci atmosférické a půdní vlhkosti 2) využití světla pro tvorbu živin

BIOLOGIE VĚDA ŽIVÉ PŘÍRODY Biologické studie: CO BIOLOGIE STUDUJE ze struktury a životních funkcí živých organismů; z zákony jednotlivých a historický vývoj organismy. 3 ORGANICKÝ SYSTÉM

1. Nitrifikační bakterie jsou klasifikovány jako 1) chemotrofy 2) fototrofy 3) saprotrofy 4) heterotrofy TÉMA „Fotosyntéza“ 2. Energie slunečního světla se v buňkách přeměňuje na chemickou energii 1) fototrofy

MIKROBIOLOGIE A GENETIKA Úkol 1. Připravte a analyzujte přípravky ze dvou známých fermentovaných mléčných výrobků. (max. 10 bodů) Vybavení: Mikroskopy, hořáky nebo lihoviny, skleněné diapozitivy,

Kvalifikační testy ve specializované bance „Bakteriologická“ banka testovací položky připravit se na certifikaci Vyberte jednu nebo více správných odpovědí 1. V souladu s nařízením Státního výboru pro ochranu životního prostředí Ruské federace N povinné

Úkoly 3. Jednobuněčné a mnohobuněčné organismy. Království hub 1. Co je obsaženo v černých kuličkách na koncích dlouhých větví houby mukor? 1) mikroskopické ovoce 2) živiny 3)

FEDERÁLNÍ STÁTNÍ ROZPOČTOVÁ VZDĚLÁVACÍ INSTITUCE VYŠŠÍHO VZDĚLÁVÁNÍ „ORENBURSKÁ STÁTNÍ ZEMĚDĚLSKÁ UNIVERZITA“ Metodická doporučení pro samostatná práce studenti

Morfologie mikroorganismů Možnost 1 1. Gracilicutes jsou: A. tenkostěnné bakterie B. silnostěnné bakterie C. bakterie s defektní buněčnou stěnou. D. bakterie s jemnou buněčnou stěnou. 2. K.

Zadání pro studenty: je nutné vybrat správné odpovědi (může být od jedné do několika). Morfologie mikroorganismů Možnost 1 1. Gracilicutes jsou: A. tenkostěnné bakterie B. silnostěnné

Řasy Řasy nižší rostliny Řasy jsou rozsáhlá a heterogenní skupina nižších rostlin. Řasy jsou nejpočetnějším a jedním z nejdůležitějších fotosyntetických organismů na planetě. Setkají se

Městská rozpočtová vzdělávací instituce Alarskaya průměr všeobecná střední škola„Uvažováno“ Vedoucí zápisu ministerstva obrany ze dne 0 r. „Souhlasil“ Zástupce ředitele pro řízení vodních zdrojů MBOU 0 g „Schváleno“

1 Základní techniky práce s mikroorganismy Úkol 1. Úvod do mikrobiologie Bezpečnostní techniky při práci s mikroorganismy Úkol úkolu. Tento úkol vás seznámí s pravidly bezpečné práce v

Úkoly 2. Buněčná struktura organismů 1. Jaký chemický prvek je součástí životně důležitých organických sloučenin buňky? 1) fluor 2) uhlík 3) měď 4) draslík 2. Jako skladovací látka

Plísně jsou vlivem fyzikálních faktorů na růst a vývoj hub. Logunov Stepan 7g Projektový manažer Bulycheva M.B. Relevance výzkumu Spóry hub jsou vysoce odolné vůči nepříznivým

Test 5 Možnost 1. Téma Úkoly „Houby“ s výběrem jedné správné odpovědi. 1. Hlavní rozdíl mezi houbami a rostlinami spočívá v tom, že: mají buněčnou strukturu, absorbují vodu a minerální soli z půdy,

1. Vysvětlivka Program je určen pro ty, kteří vstupují do postgraduálního studia FSBEI HPE BSU ve specializaci 03.02.03 - Mikrobiologie Program pro přípravu vysoce kvalifikovaných odborníků ve směru

FEDERÁLNÍ VZDĚLÁVACÍ AGENTURA

STÁT KARACHAYOV-CHERKESS STÁT TECHNOLOGICKÁ AKADEMIE

Katedra výrobní technologie živočišných produktů

MIKROBIOLOGIE

INSTRUKCE

do laboratorních a praktických hodin pro studenty

agrární ústav

Cherkessk - 2010

Sestaveno na základě přibližných a pracovní programy na předmětu „Mikrobiologie“ v souladu se Státním vzdělávacím standardem vyššího odborného vzdělávání ve specializaci 110305 „Technologie výroby a zpracování zemědělských produktů“ a 110201 „Agronomie“ (2000).

Projednáno na schůzi odboru TPPZ (zápis ze dne 2. 7. 2009)

Schváleno metodickou komisí Agrární institut(Zápis č. 6 ze dne 1. 1. 2001). Zveřejněno rozhodnutím vzdělávací a metodické rady Státní technologické akademie Karachay-Cherkess (zápis ze dne 1. 1. 2001)

Zkompilovaný: kandidát biologických věd, docent , Kandidát zemědělských věd, docent , asistent

Recenzenti: – kandidát biologických věd

Docent katedry agronomie

Docent katedry „TPPZH“

Redaktor: Ph.D. Vědy, docent
Obsah

Úvod …………………………………………………………………… .. 6

1. Mikroskopie …………………………………………………………… .. 7

1.1. Mikroskopie světelného pole ………………………………………………. .7

1.1.1. Mikroskopické zařízení ……………………………………………… 7

2. Práce s mikroorganismy …………………………………………………. osm

2.1. Metody přípravy přípravků …………………………………………………………………………………………………… ... 8

2.1.1 Technika odebírání kultury pro přípravky …………………………… 8

2.1.2. Studium živých buněk mikroorganismů metodou

pokles tlaku ……………………………………………………… .. 8

2.1.3. Fixní přípravky z mikroorganismů ……………………… 9

Osvětlovací systém je umístěn pod pódiem. Zrcadlo odráží dopadající světlo do kondenzátoru. Jedna strana zrcadla je plochá, druhá je konkávní. Při práci s kondenzátorem je nutné použít ploché zrcadlo. Při práci bez kondenzátoru s čočkami s malým zvětšením se používá konkávní zrcadlo. Kondenzátor se skládá ze 2–3 čoček s krátkým zaostřením, sbírá paprsky přicházející ze zrcadla a směřuje je k předmětu. Při práci s ponornými systémy je nutný kondenzátor. Kondenzátor má clonovou clonu vyrobenou z ocelových desek ve tvaru půlměsíce.

Barevné přípravky se zvažují s téměř úplně otevřenou clonou, nezafarbené - se sníženou aperturou bránice.

Objektiv- systém více čoček, na jehož kvalitě závisí obraz objektu. Vnější čočka se nazývá přední čočka a poskytuje zvětšení. Zbytek čoček plní funkci korekce optických vad.

Čočky jsou suché a ponořené (ponoření). Při práci se suchými objektivy je mezi přední čočkou objektivu a předmětem studia vzduch. Při práci s imerzním objektivem V = 90x je mezi krycím sklem a čočkou objektivu cedrový olej, jehož index lomu je blízký indexu lomu skla 1,515, respektive 1,52. Objektivy mají zvětšení 8x, 40x a 90x.

Okulár slouží jako přímé pokračování „čoček“ (čoček) lidských očí.

Okulár se skládá ze dvou čoček - horní - oka a spodní - společné, uzavřené v kovovém rámu. Účelem okuláru je zvětšit obraz, který objektiv poskytuje. Na jeho rámu je vyryto zvětšení okuláru. Pracovní zvětšení okuláru se pohybuje od 4x do 15x.

Okuláry jsou odlišné typy, a výběr závisí na objektivu. Při dlouhodobé práci s mikroskopem používají binokulární nástavec, protože zlepšuje viditelnost objektu, snižuje jas obrazu a tím zachovává vidění.

Práce s mikroorganismy

2.1. Přípravné metody

2.1.1. Technika odebírání kultury pro přípravu

Malé množství mikrobiální hmoty se odebere ze zkumavky bakteriologickou jehlou spálenou v plameni. Pokud je kultura kapalná, pak je lepší použít k tomu smyčku, v ostatních případech - jehlu.

2.1.2. Studium živých buněk mikroorganismů metodou drcené kapky

Živé buňky mikroorganismů se zkoumají metodou drcené kapky, předmět se předem obarví životně důležitými barvivy - vitální zbarvení(barviva: methylenová modř, neutrální červená v koncentracích od 0,001 do 0,0001%).

Přípravky jsou mikroskopické, mírně ztmavují zorné pole; kondenzátor je mírně spuštěn, tok světla je regulován konkávním zrcátkem. Zpočátku používají nízké zvětšení - 8x objektiv, po detekci okraje kapky je nainstalován 40x nebo imerzní (90x) objektiv.

V případě metody drcené kapky se na čisté skleněné podložní sklíčko nanese kapka vody z vodovodu. Do něj se zavede kultura a smíchá se s vodou. Přebytečná voda se odstraní filtračním papírem. Při použití imerzního objektivu se kapka cedrového oleje nanese na skleněné podložní sklíčko a mikroskopuje se.

2.1.3. Fixní přípravky z mikroorganismů

Fixní přípravky znamenají takové zpracování živých buněk, které umožňuje rychle přerušit běh životních procesů v objektu a zachovat jeho jemnou strukturu. V důsledku fixace jsou buňky pevně přichyceny ke sklu a lépe se obarví. Fixace je nutná při práci s patogenními mikroorganismy (z bezpečnostních důvodů).

Příprava nátěru. Kapka vody z vodovodu se nanese na čisté podložní sklíčko bez tuku. K odmaštění skel se používá směs ethylalkoholu a etheru sírové v poměru 1: 1. Pomocí kalcinované bakteriologické jehly se z kultivační zkumavky odebere malé množství mikrobiální hmoty a přidá se do kapky vody. Kapka je opatrně rozmazána smyčkou na sklo na ploše asi 4 cm2.

Pokud je suspenze hustá, nejprve se zředí vodou. Za tímto účelem se pomocí kalcinované smyčky odebere malá suspenze a přenese se do kapky vody na další skleněné podložní sklíčko. Suspenze normální hustoty se potřísní tenkou vrstvou na sklo, poté se nátěr vysuší na vzduchu při pokojové teplotě nebo za nízkého tepla, přičemž se lék drží vysoko nad plamenem hořáku. Silné zahřívání přípravku během sušení se nedoporučuje, aby se zabránilo koagulaci proteinů, které narušují strukturu a tvar buněk. Vysušený přípravek je fixován.

Fixace nátěru. Provádí se nad plamenem hořáku nebo pomocí chemikálií coodbory. V prvním případě se příprava pomalu provádí třikrát až čtyřikrát spodní stranou nad plamenem hořáku, v druhém případě se používají sloučeniny chromu: formalin, kyselina osmová, aceton. Jednou z běžných fixačních technik je ošetření léčiva 96% alkoholem nebo směsí stejných objemů ethylalkoholu a etheru (Nikiforovova kapalina). Za tímto účelem jsou přípravky ponořeny do fixační kapaliny na 10-30 minut.

Zbarvení přípravku. Na nátěr se nanese několik kapek barviva. V závislosti na typu barviva a účelu studie se doba barvení pohybuje od 1 do 5 minut, v některých případech to trvá až 30 minut. Na konci barvení se přípravek promyje vodou, voda se odstraní filtračním papírem, vysuší se na vzduchu a mikroskopuje.

Existují jednoduché a diferencované metody malování.

Na jednoduchý k barvení se používá jakékoli jedno barvivo (methylenová modř, fuchsin, enciánová fialka), celá buňka se obarví.

Na diferencované Barvením jsou jednotlivé buněčné struktury obarveny různými barvivy (Gramovo barvení, barvení spor).

Studium morfologie mikroorganismů

3.1. Tvar buňky

3.1.1. Bakterie

Ve tvaru jsou všechny bakterie rozděleny na sférické (koky), tyčinkovité a zvlněné.

Globulární bakterie - koky.

1. Mikrokoky - jednotlivé sférické buňky ( Mikrokokus agilis).

2. Diplococi - sférické koky, spojené po dvou. ( Azotobacter chroococcum).

3. Tetracocci- sférické koky, spojené ve čtyřech.

4.Streptokoky- globulární bakterie spojené v řetězcích (hlavně patogenní, stejně jako bakterie mléčného kvašení Lactococcus lactis).

5. Sarcinas- globulární bakterie, seskupené podle 8 buněk, vznikají v důsledku buněčného dělení ve třech vzájemně kolmých rovinách. Některé druhy sarcinů tvoří velké pakety ve tvaru krychle, ve kterých jsou na každé straně 4 sarciny. Typický zástupce Sarcina flava(sarcinum žlutá) - nejběžnější zástupce mikroflóry vzduchu.

Všechny sférické formy bakterií, s výjimkou Streptoctococcus lactis, při pohledu na fixní a fuchsinem obarvené přípravky.

Tyčinkovité bakterie. Patří sem formy, které nevytvářejí kontroverze (porod Pseudomonas, Achromobacter, Lactobacillus a další) a vytváření sporů (porod Bacil, Clostridium atd.).

Hůl tvořící výtrusy Pseudomonas stutzeri – jeho cytoplazma je obarvena rovnoměrně.

Výtrusné tyče Bacillus mycoides a Bacillus mesentericus. Pod mikroskopem vypadají nerovnoměrně. Spóry nejsou zbarveny jako hustší struktury. Buňky Bacil mycoides uspořádané v řetězech, to jsou streptobacily.

Tyčinkovité bakterie jsou prohlíženy na fixovaných a obarvených podložních sklíčkách.

Zakřivené tvary

1. Vibrios – mírně zakřivené buňky.

2. Spirillae může mít jednu vlnu ve tvaru ruského písmene C, dvě kadeře ve tvaru latinského písmene S nebo několik - ve formě spirály.

3. Spirochety - dlouhé a tenké buňky se spoustou kadeří; délka buněk přesahuje jejich tloušťku 5-200krát.

Vibrios a spirillae se pohodlně zobrazují na fixovaném a barevném přípravku připraveném ze suspenze, který byl předtím několik dní inkubován v termostatu. Z mnoha mikroorganismů na takovém přípravku se často nacházejí spletité formy.

Se spirochetami se můžete seznámit na fixně obarveném preparátu zubního plaku, úspěšné jsou zejména přípravky na škrábání z kazivého zubu. Zubní spirochety jsou velmi tenké, chlupaté, krátké (pouze 2–3 kadeře).

3.1.2. Aktinomycety

Aktinomycety jsou zářivé houby. Mycelium aktinomycetů na živném médiu je diferencované: jedna jeho část je ponořena do substrátu (substrátové mycelium), druhá je umístěna nad substrátem (vzdušné mycelium).

Mnoho zástupců aktinomycetů produkuje pigmenty; proto je jejich vzdušné mycelium a zejména kolonie zbarveny modře, modře, purpurově, růžově, hnědě, hnědě nebo černě. Aktinomycety barví kultivační médium ve vhodných barvách.

Kousek kolonie aktinomycete je nanesen na sklíčko společně s médiem. Druhým skleněným sklíčkem je tento kus pevně přitlačen ke sklu, rozdrcen a namazán na sklo. Droga se suší, fixuje, barví, prohlíží se pod mikroskopem, kde jsou částečně viditelná myceliální jednobuněčná vlákna.

3.1.3. Droždí

Kvasinky - jednobuněčné mikroskopické houby různých tvarů: eliptické, hruškovité, kulaté, válcovité. Rozmnožujte se vegetativně a sexuálně.

Pro laboratorní studie se používají pekařské kvasnice. Malý kousek kvasnicové hmoty několik hodin před vyučováním se umístí do teplé cukrové vody a umístí se na teplé místo. Vytvoří se bělavá, zakalená kapalina. Kapka této kapaliny se nanese na skleněné podložní sklíčko, přikryje krycím sklem, kapka cedrového oleje se nanese na povrch a přípravek se prohlédne ponorným systémem. Pučící a dělící se buňky jsou viditelné.

3.2. Metody chemického výzkumu

3.2.1. Gramové barvení buněk mikroorganismů

Tato metoda diferenciace mikrobiálních buněk je založena na rozdílu v chemické složení buněčné membrány. V buňkách některých typů mikroorganismů se tvoří v alkoholu nerozpustná sloučenina jodu s hlavním barvivem, zatímco u jiných druhů se tato sloučenina dočasně objeví a rozpustí se po působení alkoholu. Nazývají se mikroorganismy první skupiny grampozitivní druhý - gramnegativní.

Gramovo barvení. Na odtučněné skleněné podložní sklíčko se nanesou tři tenké nátěry různých kultur mikroorganismů (dva z nich jsou kontrolní, se známým vztahem k Gramovu barvení). Nátěry se suší na vzduchu, fixují se nad plamenem hořáku a barví se 1 minutu fenolovým roztokem enciánové fialky (nebo krystalové fialky), přičemž sklenici drží v mírně nakloněné poloze. Poté se barvivo slije a bez oplachování přípravku vodou se na něj 1 minutu aplikuje Lugolov roztok (dokud nátěr zcela nezčerná). Sklo je drženo v nakloněné poloze. Léčivo, bez oplachování vodou, se zpracovává za nepřetržitého třepání 96% alkoholem po dobu 15-20 s. Je důležité dodržet dobu odbarvení, protože při překročení stanovené doby dochází také k odbarvení grampozitivních buněk.

Po opláchnutí vodou se přípravek obarví 1 minutou fuchsinem Pfeifer. Grampozitivní mikroorganismy získávají tmavě purpurovou barvu a gramnegativní mikroorganismy jsou obarveny další barvou (fuchsin).

Výsledky Gramova barvení závisí na stáří kultury: ve starých kulturách jsou odumřelé buňky vždy barveny gramnegativně. Proto je lepší používat mladé jednodenní plodiny.

Droždí, Bacillus mesentericus nebo Bacillus subtilis(grampozitivní) a Escherichia coli (gramnegativní).

Barviva a činidla pro Gramovo barvení.

1. Fenický roztok hořce fialové: fialová hořec - 1 g, alkohol 96% - 10 ml, krystalický fenol - 2 g, destilovaná voda - 100 ml.

V některých případech použijte roztok hořečnatého alkoholunachový: fialová hořec (nebo krystalová fialová) - 1 g, 96% alkohol (rektifikovaný) - 100 ml, glycerin - 5 ml. Směs se umístí na 24 hodin do termostatu a poté se zfiltruje.

2. Lugolovo řešení(jodit draselný - 2 g, krystalický jód - 1 g, destilovaná voda - 300 ml). Nejprve se připraví koncentrovaný roztok joditu draselného v 5 ml vody, v něm se rozpustí jód a poté se do 300 ml přidá voda.

3. Alkohol 96%.

4. Fuchsin Pfeifer(vodný roztok Tsil karbolic fuchsinu): 1 ml Tsil karbolic fuchsinu a 9 ml destilované vody. Připravuje se takto: 1 g fuchsinu, 5 g krystalického fenolu, 96% alkoholu - 10 ml, několik kapek glycerinu, 100 ml destilované vody, fuchsin se rozpustí v ethanolu, přidá se fenol rozpuštěný ve vodě. Roztok se míchá a nechá se několik dní. Před použitím se filtruje.

3.2.2. Zbarvení spor v bakteriích

Spory bakterií jsou ve srovnání s vegetativními buňkami vysoce odolné vůči nepříznivým podmínkám prostředí. Jsou to kulaté, oválné nebo eliptické útvary. Pokud průměr spóry nepřekročí průměr buňky, ve které je spor vytvořen, buňka se nazývá bacilární, pokud překročí, pak se v závislosti na umístění spory ve středu nebo na konci buňky tato buňka nazývá odpovídajícím způsobem klostridiální nebo plektridiální . V bacilární buňce může být spor umístěn uprostřed buňky - centrální pozice, na konci - terminál a blíže k jednomu konci - subterminál pozice.

Při pozorování živých spórotvorných bakterií lze jejich spory odlišit silnějším lomem světelných paprsků. Spóry jsou odolné vůči kyselinám, takže je obtížné je barvit barvivy. To se vysvětluje vysokou hustotou membrány, nízkou koncentrací volné vody v ní a vysokým obsahem lipidů ve sporech. V přípravcích barevných jednoduchými způsoby nebo podle Gama spory zůstávají bezbarvé (negativní zbarvení).

Všechny metody barvení spor jsou založeny na společný princip: nejprve se spóry leptají různými látkami: chromovou, chlorovodíkovou, sírovou, kyselinou octovou, čpavkem, louhem sodným nebo peroxidem vodíku, poté se buňka se spórem při zahřátí obarví a nakonec se cytoplazma zabarví a dodatečně obarví kontrastní barvivo.

Ziehl-Nielsenova metoda upravená Müllerem. Před fixací bakteriálního nátěru na plamen se přípravek připraví obvyklým způsobem. Dále se na ochlazený nanese 5% roztok kyseliny chromové a fixuje se v plameni. Po 5-10 minutách se smyje vodou. Preparát je pokryt pásem filtračního papíru a papír je hojně navlhčen karbolickým fuchsinem Tsil. Přípravek zahřívejte na plameni, dokud se neobjeví páry (ne k varu), poté jej odstavte a přidejte novou část barviva. Tento postup se provádí po dobu 7 minut. Je důležité, aby se barvivo odpařilo, ale aby papír nevyschl. Po ochlazení se odstraní, přípravek se promyje vodou a důkladně se přefiltruje filtračním papírem. V důsledku tohoto ošetření jsou buňky se spory rovnoměrně obarveny.

Dále se cytoplazma buněk (ale ne spóry) odbarví ošetřením 1% roztokem kyseliny chlorovodíkové nebo sírové po dobu 15-30 s. Při přípravě přípravku výtrusy Bacil mycoides nebo Bacil mesentericus doporučuje se odbarvit cytoplazmu po dobu 16-18 s (měřeno nahlas od 21 do 37-40). Pokud je tento čas překročen, mohou se také změnit barvy spór. Poté se přípravek promyje vodou a obarví methylenovou modří po dobu 2 minut.

Barva je kontrastní a jasně červené spory jasně vystupují na modrém pozadí cytoplazmy.

Peshkovova metoda. Lefflerova methylenová modř se nalije na přípravek fixovaný v plameni, přivede k varu a vaří se 15–20 s, přičemž sklenici drží nad plamenem. Nátěr se promyje vodou a barví se 30 s 0,5% vodným roztokem neutrální červeně. Znovu opláchněte, osušte a poté zkoumejte přípravek s olejovým ponořením objektivu. Výtrusy jsou zbarveny modře nebo modře, cytoplazma - růžově.

Pro studium sporů mohou být pohodlné předměty Bacil mesentericus nebo Bacil mycoides ve věku 4 dnů.

Činidla pro barvení bakteriálních spor. 1. Karbolický fuchsinTsilya(viz 3.2.1).

2. Lefflerova methylenová modř(viz 3. 2. .1).

3. Nasycený vodný roztok methylenové modři. 2 g barviva a 100 ml destilované vody.

4. Kyselina chromová, 5% roztok.

5. Sůl(nebo kyselina sírová, 1% roztok.

4. Kultivace mikroorganismů

4.1. Kulturní média

4.1.1. Příprava kultivačních médií

Maso-peptonový vývar (BCH). Pro přípravu maso-peptonového média použijte masový vývar, který se získá následujícím způsobem: 500 g jemně nasekaného čerstvého masa se nalije do smaltované pánve s 1 litrem vody z vodovodu ohřátého na 50 ° C a nechá se 12 hodin vyluhovat při pokojové teplotě nebo 1 hodinu při 50-55 ° C . Maso se vyždímá, extrakt se filtruje přes gázu vrstvou vaty, vaří se 30 minut, aby se srazily koloidní bílkoviny, a dvakrát se zfiltruje (poprvé přes plátno s vatou, druhé přes papírový filtr). Filtrát se přidá do 1 litru vody, nalije se do lahví, uzavře se bavlněnými zátkami a sterilizuje se při 120 ° C po dobu 20 minut (zátky baněk se nahoře uzavřou papírovými víčky).

Masný vývar lze použít kdykoli k přípravě média. Pokud jsou připraveny okamžitě, není nutná předsterilizace masového vývaru.

K přípravě BCH přidejte 5-10 g na 1 litr masového vývaru pepton(první produkt proteinové hydrolýzy) ke zvýšení kalorického obsahu média a 5 g stolní sůl k vytvoření osmotické aktivity. Médium se zahřívá, dokud se pepton nerozpustí, za stálého míchání.

Vytvořte neutrální nebo mírně zásaditou reakci média přidáním 20% roztoku Na2C03, dokud vlhký červený lakmusový papír nezmění barvu na modrou. Je vhodné použít indikátor ke kontrole pH média. bromthhymallblow: 1-2 kapky z toho se smíchají v porcelánovém šálku s kapkou vývaru. V neutrálním prostředí je bromthhymolblau lahvově zelený, v kyselém prostředí je žlutý a v zásaditém prostředí je modrý.

Po nastavení pH se médium znovu vaří po dobu 5-10 minut a proteiny, které koagulují při změně reakce média, se filtrují přes papírový filtr bez vyčeření bujónu nebo vyčištění proteinem. Za tímto účelem je čerstvý bílek vyšlehán s dvojnásobným množstvím vody a smíchán s vývarem ochlazeným na 50 ° C. Směs se vaří za míchání na mírném ohni 10 minut a poté se filtruje. Průhledný masový peptonový vývar se nalije do zkumavek, uzavře se bavlněnými zátkami a sterilizuje se při 120 ° C po dobu 20 minut.

Masový peptonový agar (MPA). Do 1 l MPB přidejte 15-20 g agaru. Médium se zahřívá, dokud se agar nerozpustí (jeho teplota tání je 100 ° C, jeho tuhnutí je 40 ° C), mírně zásaditá reakce média se zahájí 20% roztokem Na2C03 a nalije se nálevkou do zkumavek (přibližně 10 ml agaru ve sloupci pro následné nalévání do Petriho misek a 5 ml každý pro získání šikmého agaru - zásoby).

Při rozlévání agaru musí okraje trubiček zůstat suché, jinak by se zátky lepily na sklo. Zkumavky s médiem se sterilizují v autoklávu při 120 ° C po dobu 20 minut.

4.2. Sterilizační metody

Sterilizace - Toto je úplné zničení buněk mikroorganismů v živných médiích, miskách atd.

Je známo několik způsobů sterilizace. Běžněji se používá tepelná sterilizace.

4.2.1. Planoucí nebo kalcinující

Bezprostředně před použitím můžete zapálit platinové smyčky, jehly, špachtle, malé kovové předměty (nůžky, lancety, pinzety), ale i skleněné tyčinky, mikroskopická sklíčka, krycí sklíčka atd.

4.2.2. Sterilizace suchým teplem

Používá se ke zpracování nádobí a suchých materiálů, jako je škrob, křída. V tomto případě je sterilizovaný předmět uchováván při 170 ° C po dobu 2 hodin (od okamžiku, kdy je stanovena požadovaná teplota) v elektrických sušících skříních. Nedoporučuje se zvyšovat teplotu nad 170 ° C: vatové tyčinky a papír se začínají zhoršovat.

Před sterilizací se skleněné zboží uzavře bavlněnými zátkami a zabalí do papíru. Šálky, zkumavky, pipety, vata, gáza jsou zabaleny do papíru nebo umístěny do speciálních pouzder a pouzder, do kterých lze po sterilizaci uložit sterilní nádobí.

Na konci sterilizace se skříňka otevře až poté, co teplota klesne na pokojovou teplotu, jinak se sklo může rozbít.

4.2.3. Sterilizace proudící párou

Tekoucí pára (100 ° C) se používá k ošetření předmětů, které se zhoršují suchým teplem, a některých živných médií, která nemohou odolat vyšším teplotám (média se sacharidy, MPF, mléko). Sterilizace se provádí v kotli Koch po dobu 30 minut po dobu 3 dnů každý den. Tato sterilizace se nazývá zlomkové.

Jediným zahříváním na teplotu 100 ° C po dobu 30 minut vegetativní buňky hynou, zatímco spory mnoha mikroorganismů zůstávají životaschopné. Po takovém zahřátí se médium umístí na 24 hodin do termostatu při 28 až 30 ° C. Spóry konzervované během prvního ohřevu mají čas vyklíčit do vegetativních forem, které při následném zahřívání hynou. Poté se tato operace opakuje ještě 2krát.

4.2.4. Sterilizace nasycenou párou pod tlakem

Toto je nejrychlejší a nejspolehlivější metoda sterilizace a zabíjí nejtrvalejší spory. S jeho pomocí se sterilizuje většina živných médií a nádobí.

Úprava nasycenou párou se provádí v hermeticky uzavřeném silnostěnném kotli - autokláv. Na víku nebo na boku autoklávu je vypouštěcí ventil páry, tlakoměr a pojistný ventil. Tlakoměr ukazuje, o kolik je tlak páry uvnitř kotle vyšší než obvykle. Aby se zabránilo výbuchu při překročení limitu tlaku, je spuštěn pojistný ventil, který uvolňuje páru.

Indikátor tlakoměru ve fyzické atmosféře odpovídá určité teplotě.

Spolehlivé sterilizace je dosaženo zahříváním na 120 ° C a tlakem 1 atm po dobu 20 minut.

Sterilizace se provádí následujícím způsobem. Do autoklávu se nalije voda, vloží se do ní sterilizované předměty, přišroubuje se víčko autoklávu a zahřeje se. Ventil je ponechán otevřený, dokud není veškerý vzduch v autoklávu vytlačen vodní párou. Když pára začne opouštět kohoutek v souvislém proudu, kohout se zavře, tlak páry v autoklávu se upraví na 1 atm a udržuje se na této úrovni po dobu 20-30 minut. Poté se ohřev zastaví, čekají, až jehla tlakoměru klesne na 0, opatrně (kousek po kousku) otevřou kohoutek a vypustí páru. Teprve poté odšroubujte víko autoklávu. Pokud se kohoutek otevře před poklesem tlaku, kapalina ve sterilizovaných nádobách se vaří a vytlačí z nich zátky.

Autokláv se také používá pro frakční sterilizaci proudící párou. V tomto případě není víko přišroubováno, aby mohla pára volně unikat.

4.2.5. Pasterizace

Pasterizace je neúplná nebo částečná sterilizace, což znamená zahřívání na 65–80 ° C po dobu 30–10 minut, následované rychlým ochlazením na 10–11 ° C. Mléko, pivo, víno a další produkty jsou pasterizované.

Materiály a vybavení

MPB, agar, červený lakmus, bromthhymolblow, porcelánové talíře s jamkami nebo šálky, skleněné tyčinky, 20% roztok Na2C03, zkumavky ve stojanech (pro nalévání agaru), trychtýře, vata, Petriho misky, 1 ml pipety Mohr, papír na kelímek a pipetové zábaly, 250 ml baňky, drsné nitě.

5. Počítání a izolace čisté kultury mikroorganismů

5.1. Metody počítání počtu mikroorganismů

5.1.1. Počítání počtu mikroorganismů (CFU) v půdě metodou živných desek v kombinaci s metodou postupných ředění

Půda je nejpříznivějším prostředím pro vývoj mikroorganismů. Vzhledem k vysoké heterogenitě svého složení berou na vědomí počet mikroorganismů v něm průměrný vzorek půdy.

Nejprve se připraví suspenze (metodou ředění) obsahující různé koncentrace půdy v 1 ml vody. K tomu se odebere vzorek půdy v 1 g ze sklenice nebo sáčku na sterilní hodinovou sklenici se sterilní porcelánovou špachtlí nebo hliníkovou lžičkou. Sklenice na hodinky, špachtle, lžíce se plamenem zapálí nebo zvlhčí s alkoholem a spálen. Při vážení půdy je hodinové sklo pokryto dalším sterilním hodinovým sklíčkem.

Vzorek půdy, pozorující podmínky asepse, se přenese do 250 ml baňky s 99 ml sterilní vody. Směs se třepe 5 minut, aniž by se korok zvlhčil. Sterilní pipetou odeberte 1 ml suspenze obsahující 10–2 g zeminy a přeneste ji do zkumavky s 9 ml sterilní vody z vodovodu. Pipeta se opakovaně promývá vodou ve zkumavce, aby se co nejvíce opláchly buňky z jejích stěn. Další sterilní pipetou odeberte další 1 ml suspenze z baňky a vložte ji do druhé baňky, která také obsahuje 99 ml sterilní vody z vodovodu. Tato pipeta se promyje stejným způsobem jako v prvním případě. Zkumavka a druhá baňka se protřepávají 1 minutu. Koncentrace půdy ve zkumavce bude 10-3 g, ve druhé baňce -10-4 g. Stejným způsobem se 1 ml suspenze z druhé baňky přenese novými sterilními pipetami do druhé zkumavky s 9 ml a do třetí baňky s 99 ml sterilní vody z vodovodu a připravte nové suspenze obsahující 1 ml, 10-5, respektive 10-6 g půdy.

PRAKTICKÁ PRÁCE

Pro studenty druhého ročníku

NA MIKROBIOLOGII

1. Mikrobiologická laboratoř.

2. Metody mikroskopického výzkumu. Seznámení s mikroskopem.

3. Metody barvení přípravků. Přípravné metody

pro mikroskopii.

4. Metody sběru materiálu. Kulturní média.

5. Bakteriologická výzkumná metoda na příkladu stafylokoků.

6. Kultivace a indikace virů.

9. Vliv faktorů prostředí na mikroorganismy.

10. Sérologické reakce. Aglutinační reakce.

11. Reakce hemaglutinace.

12. Reakce vazby komplementu.

13. Reakce srážek. Reakce srážení kruhu.

14. Reakce imunofluorescence. Imunitní reakce (kožní testy).

Opsonophagocytická reakce.

15. Vakcíny.

16. Sérové ​​přípravky.

Úvod

Sada nástrojů vyvinut s cílem pomoci studentům Moskevské lékařské akademie železniční dopravy MIIT s přípravou praktická práce v rámci disciplíny „Základy mikrobiologie, virologie a imunologie“.

Učební modul

Téma lekce: viz obsah

Typ lekce: praktický

Místo lekce: laboratoř mikrobiologie

Čas: 16 * 2 hodiny

Student by měl vědět:

SEKCE 1

ZÁKLADY ZDRAVOTNICKÉ

BAKTERIOLOGIE A MIKROBIOLOGIE

PRAKTICKÁ PRÁCE č. 1

Téma:"Mikrobiologická laboratoř"

Mikrobiologická laboratoř je organizována v nemocnicích a hygienicko-epidemiologických stanicích. Existují také speciální laboratoře, ve kterých pracují s patogeny zvláště nebezpečných infekcí, to jsou

virologické laboratoře atd.

Mezi úkoly mikrobiologické laboratoře patří:

1) bakteriologická diagnostika infekčních chorob;

2) sanitární a bakteriologické studie vody, vzduchu a předmětů

prostředí;

Laboratoř zahrnuje:

1) laboratorní místnost s prosklenou krabicí pro vedení

mikrobiologický výzkum (v krabici musí být nainstalován

baktericidní lampa);

2) praní;

3) přípravný (místnost pro přípravu pokrmů a další

pomocné práce);

4) autokláv;

5) prostor pro příjem analýz a vydávání výsledků výzkumu;

6) vivárium;

Mikrobiologická laboratoř musí být vybavena:

• termostat,
• lednička,
• sušicí komory,
• odstředivka,
• laboratorní sklo;

Stejně jako vybavení:

• lihový nebo plynový hořák
• bakteriologické smyčky
• des. řešení